Shh信號通路對快速老化小鼠腎臟衰老的影響

葉成 杜艷軍,2 劉欣媛 鄧曉妮 吳文輝

(1湖北中醫藥大學針灸骨傷學院,湖北 武漢 430061;2針灸治未病湖北省協同創新中心)

腎臟與其他臟器協同維持機體的內環境穩定、保證正常生理功能的運行,是人體的重要器官。然而,隨著時間推移,細胞功能逐漸減退,腎臟不可避免地出現形態結構變化及生理功能退行性改變。其中,纖維化是衰老腎臟最為顯著的病理特征之一,包括腎小球硬化及腎間質纖維化。同時,腎纖維化是目前已知的各種不同因素導致的慢性腎臟病發展至終末期腎病的病理特征和必經途徑,腎纖維化嚴重程度與腎功能下降之間存在線性關系,也是一項決定預后發展的可靠指標〔1〕。

近年來,國內外有學者觀察發現快速老化(SAMP)8小鼠腎臟在老年期具有典型的纖維化病理表現〔2～4〕,然而Shh信號通路與該品系小鼠腎臟病理改變之間的關系目前尚未見研究報道。本實驗旨在通過對比同齡抗快速老化(SAMR)1小鼠,觀察快速老化SAMP8小鼠老年期腎臟病理變化及Shh信號通路中Shh、平滑蛋白(Smo)、膠質瘤相關癌基因同源物(Gli1)蛋白表達水平。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 6只雄性SAMP8小鼠,6只雄性SAMR1小鼠為對照,均購自北京大學醫學部〔實驗動物科學部,許可證號:SCXK(京)2016-0010〕,月齡為10個月,體質量為(35±5)g。均在SPF環境下喂養,溫度為 (22±2)℃,自然光線,自由飲水,普通飼料(非鋁制品的器皿中存放)。整個實驗過程嚴格遵守國家科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2主要實驗試劑和儀器 Shh一抗(北京博奧森BIOSS,BS-1544R),Smo一抗(武漢三鷹PTG,66851-1-IG),Gli1一抗(北京博奧森BIOSS,BS-1206R),熒光二抗(488山羊抗兔,Jackson111-545-003),熒光二抗(488山羊抗鼠,Jackson111-545-003),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,索萊寶C0060),抗熒光淬滅封片劑(southbiotech0100-100)。

1.3動物取材 麻醉后用脫頸法處死,組織剪沿皮膚及皮下組織各層剖開腹腔,迅速剝離小鼠腎臟組織,用預冷的PBS清洗后濾紙吸干多余液體,腎臟浸泡于4%多聚甲醛用于蘇木素-伊紅(HE)、馬松(Masson)染色和免疫熒光實驗。

1.4HE染色與Masson染色 切片常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,HE染色經蘇木素染細胞核,伊紅染細胞質后在光學顯微鏡下觀察腎臟結構病理改變;Masson染色經蘇木素染色、麗春紅染色、苯胺藍染色后在光學顯微鏡下觀察腎臟組織膠原沉積情況。在400倍鏡下每張切片隨機選取10個不同視野,將呈現為藍色區域的膠原纖維視為陽性目標,以陽性區域的面積與整個視野總面積的比值為腎臟纖維化指數。采用 Image Pro Plus6.0 軟件進行半定量分析。

1.5免疫熒光 切片常規使用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化;檸檬酸抗原修復緩沖液(pH6.0)抗原修復,將玻片置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,5 min/次,吸干,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗4 ℃孵育過夜后置PBS中搖床洗滌3次,5 min/次;吸干,在圈內滴加與一抗相應種屬辣根過氧化物酶(HRP)的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50 min,再置于 PBS 中搖床洗滌3次,5 min/次;吸干,滴加DAPI染液,避光室溫孵育10 min;再置于PBS中搖床洗滌3次,5 min/次后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于蔡司倒置顯微鏡下觀察并采集圖片,陽性表達呈綠色,細胞核呈藍色,并采用 Image Pro Plus6.0 軟件進行半定量分析熒光強度。

1.6統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1HE、Masson染色病理表現 HE染色觀察小鼠腎臟組織病理學改變,Masson染色觀察腎臟組織纖維化程度,結果顯示,SAMR1組腎臟未見明顯異常病理變化,腎小管結構清楚、完整,腎小球結構清晰,形態規則,系膜細胞及間質無明顯改變,血管周圍間質僅見少量炎性細胞浸潤,腎小球基底膜及腎小管間質處見少量陽性著染,膠原纖維沉積較少;與SAMR1組比較,SAMP8組腎臟于鏡下可見明顯病理損傷,腎小管上皮細胞水腫、空泡樣變性,小管間質處有炎性細胞浸潤;腎小球體積增大、充血,系膜增生,基底膜增厚,血管周圍間質有大量炎性細胞浸潤;腎小球及腎小管出現明顯藍色著染,表明膠原沉積較多,纖維化明顯。SAMR1組、SAMP8組腎臟纖維化表達面積占比具有顯著差異〔(15.32±1.32)%、(4.10±1.30)%,P<0.01〕。見圖1、圖2。

圖1 兩組腎臟組織(HE染色,×400)

圖2 兩組腎臟組織(Masson染色,×400)

2.2一般情況 SAMR1組生長狀態良好,反應靈敏,食欲旺盛,毛發光亮,二便正常;SAMP8組精神萎靡,活動能力降低,食量減少,毛發無光澤且有部分脫落,大小便減少。解剖后對腎臟組織進行觀察可見SAMR1組腎臟大小正常,色暗紅質軟;而SAMP8組腎臟稍腫脹增大,呈暗褐色,質地偏硬。

2.3Shh、Smo、Gli1的免疫熒光表達 Shh、Smo、Gli1蛋白的表達主要集中在腎小管,在腎小球中鮮有表達。SAMP8組腎小管中Shh、Smo、Gli1蛋白表達明顯高于SAMR1組(P<0.01)。見表1、圖3。

表1 兩組Shh、Smo、Gli1蛋白表達

圖3 兩組腎臟組織Shh、Smo、Gli1免疫熒光表達(×400)

3 討 論

SAM小鼠于20世紀70年代初由日本京都大學竹田俊男教授開發并沿用至今,該種類小鼠平均生存年限為12～13個月,相較于其他一般小鼠縮短了2～3倍,同時因其具有與人類老化性疾病所相似的相關衰老病理表現,而成為目前最廣泛運用于研究衰老的哺乳類動物模型。SAMP8小鼠作為SAM小鼠中的一個品系,經過研究證實其短壽,學習和記憶能力缺損,免疫反應低下且隨年齡增長而加速衰退等特點〔5,6〕。

腎臟是受損傷、衰老等因素影響時變化較為明顯的器官。在年齡增長過程中,腎小球硬化及腎小管間質纖維化是伴隨著衰老所產生的特征性變化,腎臟結構與血流動力學發生改變導致腎臟功能進行性惡化甚至喪失〔7～9〕。因此,調控腎纖維化的相關信號通路受到高度關注,包括Shh、Wnt/β-catenin、轉化生長因子(TGF)-β1/Smad、m-TOR、細胞外調節蛋白激酶(ERK)-1/2、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、肝細胞生長因子(HGF)/c-met等信號通路〔10～12〕。其中,Shh信號通路主要是由分泌型糖蛋白配體、跨膜蛋白受體復合物Ptch和Smo及下游轉錄因子Gli蛋白組成。在胚胎期,該通路高度活化,調控著細胞的增殖、分化,參與腎臟組織的形成,維持機體的穩態;在成體期,該通路高度保守,鮮有表達。然而,當Shh信號通路異常激活會引發腎臟纖維化、腫瘤等發育異常。有研究發現Shh信號通路不僅能通過復雜的網絡機制聯系串話Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad等常見通路,共同影響腎纖維化的進展,還能直接靶向作用于肌成纖維細胞的活化、增殖與轉化〔13〕。本實驗結果表明Shh信號通路的異常激活參與了腎纖維化過程。

綜上,Shh信號通路與腎纖維化密切相關的聯系在SAMP8衰老小鼠中有明顯表現,然而對于抑制Shh信號通路與改善腎纖維化仍需深入研究,以期更好地指導衰老相關的腎纖維化臨床治療。