環狀RNA KMT2E靶向miR-204-5p/MMP9軸對高糖條件下人晶狀體上皮細胞凋亡的影響

陳雪紅 吳子東 莊海容 陳圣文

(海南醫學院第二附屬醫院眼科,海南 海口 570000)

糖尿病是一種慢性全身性疾病,其眼部并發癥,如白內障,可導致嚴重的視力障礙〔1〕。在全球人群中,白內障是導致失明的主要原因,與其他人群相比,糖尿病患者白內障的發病率更高〔2〕。預計到2040年將有超過6億人患有糖尿病,并且由于糖尿病患者的壽命越來越長,患有糖尿病視網膜病變和視力障礙的人數預計將迅速增加〔3〕。糖尿病性白內障(DC)是糖尿病最重要的并發癥之一,會導致嚴重的視力喪失;晶狀體上皮細胞(LEC)的病理改變是糖尿病患者發生DC的直接原因,當人LEC暴露于高糖(HG)條件下,會發生凋亡和氧化應激,參與DC的形成〔4〕;但具體機制尚不十分清楚。

非編碼RNA(ncRNA)在DC的發展中起著關鍵作用,ncRNA的異常表達可導致LEC發生細胞凋亡、焦亡及自噬異常,使晶狀體透明度下降,從而導致白內障的發生〔5,6〕。共價閉合單鏈環狀RNA(circRNA)是一類新發現的內源性RNA,通過海綿吸附微小RNA(miRNA)參與各類疾病的病理過程。KMT2E,又稱MLL5,是影響糖尿病視網膜神經血管單元損傷的調節基因之一〔7〕。研究顯示,環狀RNA KMT2E(circ KMT2E)在DC晶狀體中上調,miR-204-5p在DC中呈低表達,circ KMT2E可能作為miR-204-5p的海綿分子參與DC的發病,為DC的非手術治療提供新的靶點〔8〕。但是,circ KMT2E對DC發生發展的調控機制尚有待闡明,其是否參與LEC的凋亡仍不清楚。基質金屬蛋白酶(MMP)9在DC的LEC中表達增加,并在DC的發生發展中起重要作用〔9〕;而且MMP9和miR-204-5p之間存在結合位點,miR-204-5p可直接靶向MMP9基因,調節人視網膜母細胞瘤細胞的增殖和侵襲〔10,11〕。本研究探討HG條件下人LEC中circ KMT2E和miR-204-5p的表達及其對LEC凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人晶狀體上皮細胞系(HLE-B3)購自美國ATCC,細胞在含有10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素G 100 U/ml,鏈霉素100 μg/ml)的低葡萄糖DMEM培養基中在37 ℃,5% CO2的濕潤環境中培養。培養的HLE-B3細胞在達到80%～90%匯合時進行傳代。使用2～5代的細胞進行實驗。

胎牛血清、低糖DMEM培養基購自美國Gbico公司;葡萄糖粉(G8150)購自北京Solarbio公司;Lipofectamine3000轉染試劑(L3037)購自Sigma-Aldrich;用于KMT2E敲低的siRNA(si-KMT2E)及其陰性對照、circ KMT2E過表達質粒(pcDNA3.1-KMT2E)及其陰性對照、miR-204-5p mimic及其陰性對照(miR-NC)、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)引物均由RiboBio(中國廣州)合成;TRIzol試劑(RR420A)、逆轉錄(PrimeScript RT)試劑盒(RR037A)、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(RR390A)購自日本TaKaRa公司;RIPA裂解液(P0013B)、CCK-8(C0038)和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(P0010)購自碧云天生物科技公司;兔源一抗MMP9(ab283575)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2(ab194583)、Bcl-2相關X蛋白(Bax,ab32503)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3(ab2302)、GAPDH(ab128915)、山羊抗兔IgG H&L辣根過氧化物酶(HRP,ab205718)購自英國abcam公司。

細胞培養箱、NanoDrop ND-2000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司);iMark680多功能酶標儀、FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國Bio-Rad公司);ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(美國應用生物系統公司);BX61電動顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2實驗方法

1.2.1臨床樣本采集 收集自2018年12月至2020年11月在海南醫學院第二附屬醫院眼科中心進行白內障手術的33例非DC患者(男18例,女15例;年齡52～60歲)和33例DC患者(男16例,女17例;年齡45～56歲)的晶狀體前囊膜。本研究遵循修訂后的赫爾辛基宣言原則,經醫院倫理委員會批準。在獲得患者知情同意的情況下收集所有樣品。患者都接受了完整的術前眼科檢查,晶狀體前囊膜樣本通過完整的連續曲線撕囊術獲得,沒有血管接觸或虹膜或其他眼內結構的損傷。非DC患者作為對照組,有糖尿病但無增殖性糖尿病視網膜病變的患者作為DC組。DC組均為2型糖尿病,根據晶狀體混濁分類系統Ⅲ,患者均Ⅲ級皮質性白內障。接受眼科手術或非糖尿病性視網膜病變的眼部疾病患者被排除在研究之外。

1.2.2LEC凋亡檢測 將部分晶狀體前囊膜置于4 ℃、4%多聚甲醛溶液中固定12 h,常規石蠟包埋后連續切片備用。然后按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作,光學顯微鏡下觀察LEC凋亡情況(凋亡細胞呈棕黃色)并拍照。

1.2.3RT-qPCR檢測晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達水平 取部分晶狀體前囊膜,使用TRIzol試劑提取總RNA,分光光度計檢查RNA濃度。使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行RT-qPCR。RT-qPCR使用以下熱循環條件:95 ℃初始變性3 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s和72 ℃ 1 min的40個循環。使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達水平,用內部參考基因GAPDH或U6進行標準化。引物序列:circ KMT2E正向:5′-TCAGAGGAGCAGATTGCAGA-3′,反向:5′-CGCATAGG-GCAAACCAAT-3′;miR-204-5p正向:5′-ACACTCCAGCTGGGTTCCCTTGTCATCCTAT-3′,反向:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;MMP-9正向:5′-AGACCTGGGGCAGATTCCAAAC-3′,反向:5′-CGGCAAG-TCTTCCGAGTAGT-3′;U6正向:5′-GCTTC-GGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向:5′-CGCTTCACGAA-TTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH正向:5′-CTTTGGTAT-CGTGGAAGGACTC-3′,反向:5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′。

1.2.4高糖濃度及作用時間的篩選 取生長狀態良好的HLE-B3細胞,棄去培養基,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,胰酶消化離心,用含10%胎牛血清的低糖培養基(5 mmol/L)重懸,然后進行細胞計數。以1×103個細胞/孔的密度接種于96孔板中,放入37 ℃,5%CO2的培養箱中進行培養,24 h后,加入不同葡萄糖濃度(終濃度為25、50、100、200 mmol/L)的DMEM培養基,繼續培養0、24、48 h后,每孔加入10 μl CCK-8試劑,繼續培養2 h。使用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔光密度(OD)值。OD值越大,表示細胞活力越強。

1.2.5細胞分組與轉染 取生長狀態良好的HLE-B3細胞,接種于24孔板中(2×106個細胞/孔),培養24 h待細胞融合到80%時,進行轉染。實驗分為8組:對照組(正常葡萄糖5 mmol/L處理24 h,不進行轉染)、HG組(高濃度葡萄糖200 mmol/L處理24 h,不進行轉染)、沉默對照組(轉染si-KMT2E陰性對照)、KMT2E沉默組(轉染si-KMT2E)、過表達對照組(轉染pcDNA3.1-KMT2E陰性對照空載體質粒)、KMT2E過表達組(轉染pcDNA3.1-KMT2E質粒)、KMT2E過表達+miR-NC組(pcDNA3.1-KMT2E質粒和miR-204-5p mimic陰性對照miR-NC共轉染HLE-B3細胞)、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組(pcDNA3.1-KMT2E質粒和miR-204-5p mimic共轉染HLE-B3細胞),轉染按照Lipofectamine3000試劑說明進行。轉染后將HLE-B3細胞用含高濃度葡萄糖200 mmol/L的培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h。收集細胞,RT-qPCR檢測轉染后各組細胞中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達水平,驗證轉染效果,檢測步驟同1.2.3。

1.2.6CCK-8法檢測細胞活力 HLE-B3細胞按照1.2.5中步驟處理,高濃度葡萄糖培養基培養24 h后,每孔加入10 μl CCK-8試劑,繼續培養2 h。使用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔OD值。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡 HLE-B3細胞按照1.2.5中步驟處理,高濃度葡萄糖培養基處理24 h后,胰蛋白酶收集細胞,PBS洗滌后懸浮在結合緩沖液中。然后,將細胞(5×105個細胞)與5 μl 膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)一起在室溫下避光孵育15 min。使用流式細胞儀鑒定和分析凋亡細胞的百分比(凋亡率)。

1.2.8Western印跡檢測細胞中MMP9、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達 HLE-B3細胞按照1.2.5中步驟處理后,使用RIPA緩沖液提取細胞蛋白質。BCA試劑盒定量蛋白質濃度,取等量的蛋白質進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。隨后,將PVDF膜在室溫下用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,與MMP9、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、GAPDH一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。然后,將PVDF膜在TBST中洗滌并與HRP標記的二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h。增強型化學發光試劑盒(ECL)顯色,觀察這些膜中的蛋白質。蛋白條帶的灰度值由ImageJ軟件確定,以GAPDH為內參,通過與內參的灰度比,得出目的條帶的相對表達水平。

1.2.9雙熒光素酶報告基因檢測 Starbase v2.0數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預測miR-204-5p和circ KMT2E的潛在靶序列。將KMT2E的野生型(WT)或突變型(MUT)3′-非翻譯區插入包含海腎熒光素酶的pmirGLO載體中以構建KMT2E-WT或KMT2E-MUT質粒。然后將HLE-B3細胞(1×105個細胞/孔)接種到24孔板中,分為miR-NC組和miR-204-5p mimic組,使用Lipofectamine3000將KMT2E-WT、KMT2E-MUT分別與miR-NC、miR-204-5p mimic共轉染到HLE-B3細胞,在37 ℃下孵育48 h后,使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性;海腎熒光素酶活性用作標準化。

1.3統計學分析 所有實驗進行3次。采用SPSS20.0和GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗,方差分析,組間有差異進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。采用Pearson法分析DC患者晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9表達水平的相關性。

2 結 果

2.1晶狀體前囊膜中LEC凋亡率 與對照組〔(21.40±2.73)%〕相比,DC組晶狀體前囊膜中LEC凋亡率〔(35.02±3.68)%〕顯著升高(t=17.076,P<0.01),見圖1。

圖1 兩組晶狀體前囊膜(TUNEL染色,×200)

2.2晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達水平 與對照組相比,DC組晶狀體前囊膜中circ KMT2E、MMP9 mRNA表達水平顯著升高,miR-204-5p水平顯著降低(均P<0.01),見表1。

表1 兩組晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達

2.3DC組晶狀體前囊膜中circ KMT2E與miR-204-5p、MMP9 mRNA表達量的相關性 DC組晶狀體前囊膜中circ KMT2E與miR-204-5p表達呈負相關(r=-0.874,P<0.01),miR-204-5p與MMP9 mRNA呈負相關(r=-0.963,P<0.01),circ KMT2E與MMP9 mRNA表達呈正相關(r=0.842,P<0.01)。

2.4最佳高糖濃度及作用時間 與低糖組相比,25、50、100、200 mmol/L濃度的葡萄糖作用于HLE-B3細胞后,在200 mmol/L作用24、48 h可顯著抑制HLE-B3細胞活力(P<0.05),見表2;因此,選擇200 mmol/L葡萄糖作用24 h為造模條件進行后續實驗。

表2 不同濃度葡萄糖對HLE-B3細胞活力的影響

2.5轉染后各組細胞中circ KMT2E、miR-204-5p、MMP9 mRNA和蛋白表達水平 與對照組相比,HG組circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著升高,miR-204-5p水平顯著降低(P<0.05);與HG組相比,KMT2E沉默組circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著降低,miR-204-5p水平顯著升高(P<0.05),KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著升高,miR-204-5p水平顯著降低(P<0.05);與KMT2E過表達組相比,KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著降低,miR-204-5p水平顯著升高(P<0.05),見圖2、表3。

表3 各組HLE-B3細胞中circ KMT2E、miR-204-5p、MMP9 mRNA和蛋白表達比較

1～8:對照組、HG組、沉默對照組、KMT2E沉默組、過表達對照組、KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組;圖4同圖2 各組HLE-B3細胞中MMP9蛋白表達

2.6各組細胞活力與凋亡率 與對照組相比,HG組細胞活力顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與HG組相比,KMT2E沉默組細胞活力顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組細胞活力顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與KMT2E過表達組相比,KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組細胞活力顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖3、表4。

表4 各組HLE-B3細胞活力、凋亡率、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較

圖3 各組HLE-B3細胞凋亡率

2.7各組細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達 與對照組相比,HG組Bcl-2表達顯著降低,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著升高(P<0.05);與HG組相比,KMT2E沉默組Bcl-2表達顯著升高,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著降低(P<0.05),KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組Bcl-2表達顯著降低,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著升高(P<0.05);與KMT2E過表達組相比,KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組Bcl-2表達顯著升高,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著降低(P<0.05),見表4、圖4。

圖4 各組Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達

2.8雙熒光素酶報告基因檢測結果 Starbase數據庫預測分析結果顯示miR-204-5p包含circ KMT2E的結合序列,見圖5。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,轉染后,與miR-NC組相比,miR-204-5p mimic組KMT2E-WT細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),KMT2E-MUT細胞的熒光素酶活性未受影響(P>0.05),見表5。

表5 兩組細胞中熒光素酶活性

圖5 miR-204-5p與circ KMT2E的結合序列預測

3 討 論

白內障或晶狀體混濁是世界上導致失明的主要原因。年齡和糖尿病是主要的危險因素,隨著老齡化和糖尿病人口的增加,白內障的負擔將會增加。白內障手術是恢復視力的有效方法;然而,相比于非DC患者,DC患者術后視力改善效果較差,術后滲漏發生率及黃斑中心厚度增加更明顯〔12〕。因此,需要探索創新的治療靶點。

近年來,ncRNA在DC形成機制中的研究越來越受到關注。miRNA是小的ncRNA,它通過轉錄后抑制翻譯來調節目標mRNA的表達。研究表明,miRNA可能通過調節眾多基因的表達而直接或間接參與多種疾病。已知LEC凋亡是DC的主要發病因素,MMP是一種分解LEC細胞外基質的酶。MMP-9的高表達與DC相關,并且抑制LEC中的MMP-9是預防白內障的潛在治療策略〔9,13,14〕。據報道,miR-204-5p與白內障的發病機制有關,可調節白內障氧化應激相關基因的表達〔15〕;也有報道稱miR-204-5p與糖尿病性角膜病變有關〔16〕;更重要的是,miR-204-5p可靶向調節MMP9的表達〔10,11〕。Fan等〔8〕對人DC晶狀體組織中miRNA的表達譜進行了研究,發現miR-204-5p是前五位下調的miRNA之一。本研究結果表明,miR-204-5p低表達可能與LEC凋亡相關。

circRNA 3′端和5′端共價連接成環狀,形成了一類最近被鑒定為在生物系統中廣泛且豐富的RNA。circRNA可以作為miRNA的海綿來減輕miRNA對其靶mRNA的抑制,從而參與各種疾病的病因和進展。據報道,在人類晶狀體組織中,circHIPK3沉默可上調miR-193a的表達,然后通過circHIPK3/miR-193a/CRYAA調節網絡增加人LEC的凋亡〔17〕。KMT2E是編碼賴氨酸N-甲基轉移酶(KMT)2家族的一個成員,該酶家族在調節組蛋白3賴氨酸(H3K)4翻譯后的甲基化中起著至關重要的作用〔18〕,而H3K4甲基化程度與白內障〔19〕和糖尿病〔20〕的發生發展均顯著相關。有研究對人DC晶狀體組織中與miR-204-5p相關的差異表達circRNA進行篩選,發現來源于親本轉錄本KMT2E〔染色體7(q22.3)〕外顯子4～15的circ KMT2E在DC組織中顯著上調,表現出與miR-204-5p相反的表達趨勢。此外,生物信息學預測發現circ KMT2E含有四個匹配序列以結合miR-204-5p〔8〕。表明circ KMT2E可能是DC的潛在調節因子,且miR-204-5p結合circ KMT2E的改變可能與DC的發病機制密切相關。本研究結果提示,circ KMT2E的沉默可抑制LEC凋亡,并且circ KMT2E可能與MMP9存在某種關聯。

本研究中雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,當轉染miR-204-5p mimic進入HLE-B3細胞時,KMT2E-WT的熒光素酶活性被顯著抑制。本研究結果表明,circ KMT2E可靶向調控miR-204-5p表達。基于上述證據,可以得出結論,沉默circ KMT2E可通過上調miR-204-5p,抑制MMP9的表達來減少LEC的凋亡。

綜上,沉默circ KMT2E可能通過靶向上調miR-204-5p,進而抑制MMP9表達,減少HG誘導的人LEC凋亡。本研究存在一定不足,首先,未對miR-204-5p/MMP9軸進行干預來進一步驗證circ KMT2E的作用機制;其次,circ KMT2E是否能調控其他miRNA、基因或通路參與DC中的LEC凋亡,有待進一步研究;最后,circ KMT2E在體內是否能發揮相同作用需要使用動物模型來證實。