RNF181在非小細胞肺癌中低表達并抑制腫瘤進展

梁伊靈 黃波 付星瑋 李曉波 薄威 張忠 王旭光 王柏芳 張珉

(1沈陽醫學院基礎醫學院病理教研室,遼寧 沈陽 110034;2遼寧省腫瘤醫院病理科)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一〔1〕,已成為我國城市人口惡性腫瘤的首要死因,約80%的肺癌病例為非小細胞肺癌(NSCLC),其病理類型包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等〔2〕,約75%的患者發現時已處于中晚期,5年生存率很低〔3〕。尋找調控NSCLC進展的關鍵因子,揭示其發揮調控作用的分子機制,將有助于臨床對NSCLC的診斷及治療。

環指蛋白(RNF)181又稱為HSPC238〔4〕,屬于RNF超家族,具有RING型結構域〔5〕,其基因組全長716個堿基,編碼153個氨基酸〔6〕,在胰腺、肝臟、腎臟等25個組織中均有表達〔7〕。環指結構域屬于鋅指型蛋白質結構域,由40～60個氨基酸組成,并含有C3HC4氨基酸基序(7個半胱氨酸和1個組氨酸非連續排列),可以結合兩個鋅離子(Zn2+)〔8〕,多數含有RING結構域的蛋白具有E3泛素連接酶活性,可以同時結合泛素化酶及其底物,導致底物降解,是參與泛素化途徑的重要蛋白。RNF181在多種腫瘤組織中存在表達,但在腫瘤進展過程中發揮的調控作用尚存在爭議,其在NSCLC中的表達情況及其調控腫瘤進展的分子機制目前尚無報道,需進一步深入研究。本課題通過研究RNF181對NSCLC進展所發揮的調控作用,查找其調控的關鍵靶點分子及下游信號通路,揭示其調控腫瘤進展的分子機制,以期為NSCLC臨床診斷及治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1病例選取 選取2013年6月至2018年12月經手術切除后并經病理診斷確診的肺腺癌組織45例及肺鱗癌組織30例,以各病例癌旁肺組織作為對照。患者術前均未進行放療、化療或內分泌治療,年齡38～82歲,平均年齡59.8歲;男43例,女32例;病理學分級Ⅰ級39例,Ⅱ和Ⅲ級36例,出現局部淋巴結轉移 38例。以上病例均進行蘇木素-伊紅(HE)染色,并由沈陽醫學院附屬中心醫院兩位病理科醫師復核確診,根據世界衛生組織(WHO)2015年頒布的肺癌組織學分型標準進行病理分型,并根據國際抗癌聯盟(UICC)2017年頒布的第8版肺癌腫瘤原發灶-淋巴結-轉移(TNM)分期系統進行肺癌分期、分級。本實驗經沈陽醫學院倫理委員會批準實行,患者均簽署知情同意書。

1.2免疫組織化學染色

1.2.1主要試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2～7.6)、抗原修復緩沖液(檸檬酸法,pH6.0)、內源性過氧化物酶阻斷劑、非免疫山羊血清封閉液、即用型免疫組織化學染色EliVision plus試劑盒(鼠/兔)、二氨基聯苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒等均購于福州邁新生物技術開發有限公司,RNF181單克隆抗體(鼠抗人)購于美國Santa cruz公司(SC-376343)。

1.2.2主要方法 手術切除的肺癌組織經10%中性甲醛溶液固定,采用常規石蠟包埋;制作連續的4 μm厚切片,用涂有0.5%多聚賴氨酸處理的載玻片撈出;所有切片在同一實驗室采用同一批號試劑進行后續實驗;免疫組織化學染色采用兩步法:將切片放入70 ℃烤片機烤1 h;將切片用二甲苯脫蠟,梯度酒精水化;進行抗原修復(以pH6.0檸檬酸鈉為緩沖液進行高壓修復2 min);3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶;非免疫山羊血清阻斷非特異性結合;RNF181一抗(1∶650)4 ℃孵育過夜;Evision A液、B液37 ℃各孵育15 min;DAB顯色,蘇木素復染核,自來水返藍,常規梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片觀察。結果判定:每張免疫組織化學染色切片,隨機選取10個(×400)視野,并隨機計數細胞200個,進行RNF181陽性結果判定,判定標準如下:陽性染色主要位于胞質,(1)染色強度:沒有陽性染色計0分,淺黃色計1分,棕色計2分,棕褐色計3分;(2)陽性染色范圍:陽性染色腫瘤細胞范圍<10%計0分,10%～25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,>75%計4分。兩項評分相乘得最終評分(0～12分),得分<6分為RNF181低表達,≥6分為高表達。

1.3細胞培養及轉染 A549和H1299細胞株購于中國科學院上海細胞庫,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液(Biological Industries,美國)在37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養箱中培養。RNF181質粒購自北京傲銳東源生物科技有限公司,其中RNF181 開放閱讀框(ORF)構建于PCMV6載體中,轉染此載體過表達RNF181,作為PCMV6-RNF181組,轉染PCMV6空載體作為對照,即PCMV6組。RNF181小干擾RNA(siRNA)購自蘇州吉瑪基因公司,序列分別為:①陰性對照(NC):正義引物:5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義:5′-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3′;②siRNA1:正義引物:5′-GGCGUCCUAUUUCGAUGAATT-3′,反義:5′-UUCA-UCGAAAUAGGACGCCTT-3′;③siRNA2:正義引物:5′-CCCACUGAUGACGACAUUTT-3′,反義:5′-AAGUGUCGUCAUCAGUGGGTT-3′;④siRNA3:正義引物:5′-GAUGCCUUGCCAUCACCUUTT-3′,反義:5′-AAGGU-GAUGGCAAGGCAUCTT-3′。轉染NC作為對照組,分別轉染siRNA序列②、③、④,作為RNAi1、RNAi2、RNAi3組。細胞轉染試劑為LipofectamineTM3000(購于Thermo Fisher Scientific,美國),按照說明書推薦劑量進行轉染,48 h后提取蛋白。

1.4Western印跡實驗 將H1299和A549細胞轉染48 h后,NP40裂解液(碧云天,中國)裂解細胞提取蛋白,并用二喹啉甲酸(BCA)法(碧云天,中國)進行蛋白定量。40 μg總蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,美國)上,用TBST(含5%脫脂奶粉)封閉1.5 h后。加入稀釋后的一抗,一抗稀釋比例如下:RNF181(1∶800,SantaCruz Biotechnology,美國)、細胞周期蛋白(cyclin)D1、cyclinA2、cyclinB1、內皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏附蛋白(N-cadherin)、Snail同源物1(Snail)、Snail同源物2(Slug,1∶1 000,Cell Signaling Technology,美國)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、微管蛋白(α-tublin,1∶20 000,proteintech,中國)。之后用過氧化物酶耦聯抗鼠或兔IgG(1∶1 000,Cell Signaling Technology,美國)室溫孵育2 h,滴加電化學發光(ECL)液(Thermo Scientific,美國)使用化學發光成像系統(Tanon,中國)檢測蛋白表達及活化水平。

1.5MTT實驗 饑餓培養細胞后轉染,24 h后接種于96孔板中〔4×103個細胞/(100 μl·孔)〕,每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT培養4 h,移除孔內溶液加入二甲基亞砜(DMSO,150 μl/孔),震蕩后用酶標儀(Molecular Devices,美國)檢測在490 nm處的OD值,每種處理條件均有5個復孔,連續觀察5 d。

1.6Transwell實驗 將Transwell上室底部預先鋪置基質膠,細胞轉染24 h后消化并重懸于無血清RPMI1640培養液中,上室內加入〔2×105個細胞/(100 μl·孔)〕細胞懸液,在下室內加入600 μl含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養液,放入孵箱中培養22 h后,取出孔板,吸出小室中的培養液,用棉簽擦掉上室內的細胞,PBS淋洗后將小室放入4%多聚甲醛中固定10 min后吸出,將小室放入結晶紫染液中染色5 min后經清水洗滌,倒置顯微鏡下隨機選取5個視野對侵襲細胞進行計數。

1.7流式細胞技術檢測細胞周期 采用無血清培養基饑餓培養24 h使細胞周期同步化,更換正常培養基并轉染48 h后,經胰酶消化,吹打制成單細胞懸液,PBS洗滌、離心棄上清,經75%乙醇4 ℃固定過夜,PBS洗滌、洗滌離心棄上清,加入碘化丙啶(PI)重懸細胞避光孵育30 min,流式細胞儀分析細胞周期。

2 結 果

2.1RNF181在NSCLC中低表達,并抑制腫瘤進展 免疫組織化學染色發現,RNF181主要定位于細胞質,肺癌組織中RNF181表達水平(4.19±2.10)顯著低于癌旁肺組織(9.39±1.54,t=17.17,P<0.01)。見圖1。不同肺癌臨床分期、淋巴結轉移情況對RNF181表達影響差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 RNF181的表達與臨床病理指標之間的關系〔n(%)〕

圖1 NSCLC組織中RNF181免疫組織化學染色(×400)

2.2RNF181抑制NSCLC細胞侵襲、增殖能力 Western 印跡檢測顯示,H1299及A549細胞NC組RNF181蛋白表達量顯著高于RNAi1組、RNAi2組及RNAi3組(P<0.05),2種細胞系中RNAi2干擾效果最為明顯,將其用于后續實驗。見圖2、表2。Transwell實驗結果顯示,H1299和A549細胞PCMV6-RNF181組侵襲細胞顯著少于PCMV6組(P<0.05),RNAi2組侵襲細胞顯著多于NC組(P<0.05)。見表3、圖3。MTT實驗結果顯示,2～5 d H1299和 A549細胞PCMV6-RNF181組增殖能力顯著低于PCMV6組(P<0.05),RNAi2組的增殖能力顯著高于NC組(P<0.05)。見表4。流式細胞術檢測發現,H1299和A549細胞PCMV6-RNF181組處于G0/G1期的細胞數顯著多于PCMV6組(P<0.05),RNAi2組處于G0/G1期的細胞數顯著少于NC組(P<0.05)。見圖4、表5。上述結果提示RNF181可抑制NSCLC細胞的侵襲能力,且可通過調控細胞周期抑制細胞增殖能力。

1～6:PCMV6組、PCMV6-RNF181組、NC組、RNAi1組、RNAi2組、RNAi3圖2 Western印跡檢測各組H1299、A549細胞中RNF181的過表達及干擾效率

表2 在H1299及A549細胞中過表達及干擾

表3 RNF181對NSCLC細胞侵襲能力的影響

表4 MTT實驗檢測RNF181對 NSCLC細胞增殖能力的影響

表5 RNF181對NSCLC細胞周期G0/G1期的影響

圖3 Transwell實驗檢測RNF181對NSCLC細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色,×200)

圖4 流式細胞技術檢測RNF181對NSCLC細胞周期的影響

2.3RNF181通過抑制EMT抑制NSCLC侵襲 上調H1299及A549細胞中RNF181的表達水平后,E-cadherin的表達水平顯著增高,而N-cadherin、Snail和Slug的表達水平顯著下降(P<0.05)。而敲低RNF181表達水平后得到相反的結果,E-cadherin的表達水平顯著下降,N-cadherin、Snail及Slug的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表6、圖6。上述結果提示,RNF181 可能通過抑制EMT降低H1299及A549細胞的侵襲能力。

表6 RNF181對NSCLC細胞EMT及細胞周期相關蛋白表達的調控作用

2.4RNF181通過調控細胞周期抑制NSCLC增殖 上調H1299及A549細胞中RNF181的表達水平后,cyclinD1的表達水平顯著下降(P<0.05),而下調RNF181表達水平后得到相反的結果(P<0.05),而cyclinB1、cyclinA2的表達水平并未發生相應變化(P>0.05)。見表6、圖5。上述研究結果提示RNF181可能通過抑制cyclinD1的表達水平介導細胞G1/S期阻滯,進而抑制NSCLC增殖。

1～4:PCMV6組、PCMV6-RNF181組、NC組、RNAi2組圖5 RNF181對NSCLC細胞EMT及細胞周期相關蛋白的表達調控

3 討 論

本文表明,RNF181主要定位于細胞質,其在NSCLC組織中相對低表達,且與肺癌臨床病理分期及腫瘤局部淋巴結轉移負相關,提示RNF181可能對NSCLC進展發揮抑制作用。

Transwell實驗發現RNF181可抑制A549及H1299細胞侵襲能力,同步進行的Western印跡實驗發現RNF181可上調E-cadherin的表達水平,下調N-cadherin、Snail、Slug的表達水平。E-cadherin是上皮細胞的標志物〔9,10〕,E-cadherin 表達的丟失是上皮細胞間質轉化(EMT)最早發生的步驟之一〔11〕。Snail和Slug是E-cadherin的轉錄抑制劑,N-cadherin是間質細胞的標志物,細胞發生EMT時,三者的表達水平可能相應增加〔12〕。EMT是上皮細胞逐漸失去自身特有的表型而逐漸獲得間質細胞表型的轉換過程,在生長發育,纖維化等多種生理、病理過程中發揮重要作用,尤其在腫瘤進展過程中,腫瘤細胞常通過EMT獲得更強的侵襲、轉移能力及生存能力〔13〕。本研究結果提示,RNF181可通過調控EMT抑制NSCLC細胞侵襲能力。

MTT實驗結果顯示,RNF181可以抑制A549,H1299兩種細胞的增殖能力,經流式細胞技術檢測細胞周期發現:上調RNF181的表達水平可將細胞周期阻滯于G1/S期。通過Western印跡實驗檢測發現:RNF181對cyclinA2、cyclinB1等蛋白表達水平無明顯影響,但其可引起cyclinD1表達水平下降。細胞通過進入細胞周期不斷分裂增殖,細胞周期相關蛋白及其激酶和抑制物對細胞周期發揮重要調控作用〔14～16〕,cyclinD1與CDK4/6結合可促進細胞通過G1/S期,加速分裂增殖〔17,18〕,本研究結果提示,RNF181可通過抑制cyclinD1表達水平阻滯細胞G1/S期轉換,進而抑制NSCLC增殖能力。

現有研究中對RNF181調控腫瘤進展作用的報道尚存在矛盾之處,RNF181在彌漫大B細胞淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺浸潤性導管癌中低表達,并且與腫瘤進展及不良預后相關〔5,19～24〕。研究發現,RNF181可通過發揮E3泛素連接酶作用抑制NF-κB信號通路,進而抑制彌漫大B細胞淋巴瘤的生長〔5,8〕。Wang等〔19〕發現,肝癌組織中RNF181表達水平低于癌旁組織,RNF181通過抑制細胞外調節蛋白激酶/促分裂素原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信號通路抑制肝癌細胞的體外生長和體內成瘤能力。過表達RNF181可導致肝癌的細胞周期阻滯〔25〕。采用順鉑治療肝癌時,RNF181可通過死亡受體途徑促進肝癌細胞凋亡〔26,27〕。體外細胞學實驗發現,過表達RNF181可以明顯抑制肝癌細胞的生長,而敲低RNF181可得到相反的結果〔28,29〕。RNF181在乳腺浸潤性導管癌中低表達,且與局部淋巴結轉移呈負相關〔30〕。有研究報道了胃癌組織中RNF181的表達水平低于癌旁組織,并且與腫瘤分化、腫瘤大小、臨床病理分期及患者總體生存時間呈負相關,RNF181在體外細胞學實驗及動物模型體內實驗中均可通過抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡來抑制胃癌的生長〔21〕。在人胃癌細胞系中,RNF181通過抑制ERK/MAPK信號通路活性,調控細胞周期相關蛋白cyclinD1/ D3,p21及CDK4/6的表達水平,從而控制細胞周期從G1期到S期的進展,與細胞學實驗結果相呼應,胃癌臨床標本中RNF181的表達水平與cyclinD1、CDK4的表達水平呈負相關,揭示了胃癌病變中RNF181-ERK/MAPK-cyclin D1/CDK4通路可抑制胃癌進展〔23〕。

與上述研究結果相反,部分研究發現,RNF181可促進腫瘤進展。研究發現,RNF181可增加結腸癌細胞增殖能力并可促進腫瘤血管生成〔31〕。Zhu等〔32〕發現在ERα陽性乳腺癌細胞中,RNF181通過對ERα特定位點的泛素化修飾防止其進入蛋白酶體降解,進而介導乳腺癌抵抗內分泌治療。Zhou等〔26〕發現在三陰性乳腺癌中,RNF181通過調控Hippo/YAP通路促進腫瘤細胞侵襲、遷移及增殖能力。

而基于腸癌的部分研究出現了體內、體外實驗結果不一致的現象,RNF181高表達于癌旁組織,但腸癌體外細胞學實驗中,干擾RNF181并未明顯影響腫瘤的生長能力〔33〕,而下調RNF181可明顯抑制裸鼠體內種植腸癌的生長〔34～36〕。

上述看似矛盾的結果提示,腫瘤微環境,RNF181上、下游分子表達水平及相關信號通路的活化情況均可能影響并改變RNF181的生物學功能,進而影響其對腫瘤進展的調控方向,發揮“促癌”或“抑癌”的功能,對其生物功能的研究不能脫離其周圍環境及遺傳背景等多方面因素,需要綜合考量、分析。

綜上,RNF181可分別通過調控細胞周期及EMT抑制NSCLC細胞增殖及侵襲能力,其抑制NSCLC進展作用的分子機制仍需深入研究,以期為肺癌診斷及治療提供新的靶點。