巴戟天含藥血清對高糖誘導的血管內皮細胞FOXP2/AGGF1信號通路及增殖、遷移的影響

黎珊珊 區島良 張梅 謝桃梅

(儋州市人民醫院內分泌科,海南 儋州 571700)

糖尿病(DM)是一種以高血糖、胰島素抵抗和相對胰島素缺乏為特征的代謝性疾病〔1〕。高血糖引起的血管并發癥,導致DM患者的發病率和死亡率顯著增高〔2,3〕。DM血管并發癥主要表現為血管內皮損傷和功能障礙,與血管內皮細胞數量減少密切相關〔4〕。因此,尋找新的藥物,抑制高血糖誘導的內皮細胞受損對臨床治療DM血管并發癥,改善DM治療效果具有重要意義。巴戟天是一種茜草科植物中草藥,具有治療腎虛、宮冷不孕和陽痿遺精等功效,且已被證實能夠促進血管生成〔5〕。叉頭框蛋白(FOX)P2是叉頭盒蛋白家族成員之一,能夠在轉錄水平上促進G補綴FHA域血管生成因子(AGGF)1表達,增強血管內皮細胞的增殖和遷移〔6〕。然而,巴戟天對高糖誘導下血管內皮細胞功能的影響及其作用機制尚不清楚。本實驗旨在探索巴戟天含藥血清對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖、凋亡及遷移的影響,并初步研究其與FOXP2/AGGF1通路的關系。

1 材料與方法

1.1實驗細胞、藥品及試劑 HUVEC(批號CL-0122)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;巴戟天(批號14000863870)購自國藥集團馮了性(藥材)飲片有限公司;內皮細胞培養基(ECM,批號1001)、噻唑藍(MTT)試劑盒(批號M8180)、胎牛血清(批號11011-8611)、0.25%胰蛋白酶消化液(批號T1350)、Trizol試劑盒(批號15596-018)、逆轉錄試劑盒(批號T2210-200T)、RIPA裂解液(批號R0010)、基質膠(批號356234)、電化學發光(ECL)液(批號PE0010)均購自北京Solarbio公司;膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒(批號KGA108)購自南京凱基生物科技發展有限公司;FOXP2、AGGF1及GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成;FOXP2兔抗人單克隆抗體(批號720031)、AGGF1兔抗人多克隆抗體(批號A303-633A)、GAPDH兔抗人多克隆抗體(批號PA1-16777)、山羊抗兔lgG(H+L)二抗(批號A32731)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2主要儀器 BBD6220型二氧化碳細胞培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司;2720型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購自美國ABI公司;Gel DocTMXR+型凝膠成像儀、ELX-8081U型酶標儀均購自美國Bio-Rad公司;MA100N型倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1含藥血清和不含藥血清的制備 選取5周齡健康清潔級雄性SD大鼠24只,體質量100～140 g,購自華中科技大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(鄂)2018-0009,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0057,動物質量合格證號:DM0019101307,大鼠飼養于海南省疾病預防控制中心,禁食12 h后,隨機分成4組,即不含藥血清組、0.5 g/kg巴戟天給藥組、1.0 g/kg巴戟天給藥組和2.0 g/kg巴戟天給藥組,每組6只,1 g巴戟天相當于生藥3 g,給予灌胃處理,藥物劑量等效于臨床劑量(按照人和動物表面積折算等效劑量比率計算)。給藥方式:2次/d,2 ml/次,連續灌胃3 d,第4天一次性服用全天劑量,不含藥血清組給予等量生理鹽水灌胃。禁食12 h,采血,末次給藥1 h后,乙醚麻醉,無菌條件下心臟采血、靜置2 h,離心(3 000 r/min,15 min),分離上清液,同組混合,56 ℃水浴滅活30 min,分裝后得不含藥血清、0.5、1.0和2.0 g/kg巴戟天含藥血清,-20 ℃保存備用。本實驗通過儋州市人民醫院倫理委員會批準,實驗嚴格遵循3R原則。

1.3.2細胞培養 將新購置的HUVEC用ECM完全培養基(含10%胎牛血清+1%內皮細胞生長因子+1%青霉素/鏈霉素混合液)于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養,待細胞融合80%左右,胰酶消化傳代,收集3～5代對數期生長的細胞用于后續實驗。

1.3.3高糖模型的建立 將1.3.2中HUVEC接種于96孔板(4.5×104個/孔),隨機分為對照組和高糖組,D-葡萄糖終濃度為:對照組(5.5 mmol/L)、高糖組(10、15、20、30、40 mmol/L),每組6個復孔,并設置調零孔,培養24 h,采用MTT法檢測各組細胞存活率:吸去上清液,每孔添加100 μl二甲基亞砜(DMSO),充分震蕩后,酶標儀檢測各孔570 nm下吸光值(OD值),計算存活率,存活率(%)=(實驗孔OD值-調零孔OD值)/(對照組OD值-調零孔OD值)。取存活率為50%左右的高糖濃度建立HUVEC損傷模型。

1.3.4含藥血清干擾后細胞活性檢測 收集1.3.3中使用30 mmol/L D-葡萄糖誘導24 h的HUVEC,接種于96孔板(4.5×104個/孔),隨機分為空白對照組、對照組、巴戟天低、中、高劑量組,用1.3.1中制備的不含藥血清和不同濃度的巴戟天含藥血清對應處理對照組、巴戟天低、中、高劑量組細胞,空白對照組不做任何處理,24 h后,采用MTT法檢測各組細胞的存活率。

1.3.5Annexin Ⅴ-FITC/PI實驗 收集1.3.2中HUVEC,接種于6孔板(1.2×106個/孔),按照1.3.4中方法隨機分組并處理,每組設置6個復孔。胰酶(不含EDTA)消化收集細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗、離心、500 μl結合緩沖液重懸,加入10 μl/管Annexin Ⅴ-FITC和5 μl/管 PI,混合均勻,避光保存15 min,吹打均勻后,流式細胞儀檢測各組HUVEC凋亡情況。凋亡率(%)=凋亡早期細胞比例+凋亡晚期細胞比例。

1.3.6劃痕實驗 調整1.3.2中HUVEC密度為6×105個/ml,接種于6孔板(2 ml/孔),待細胞匯合率大于85%,使用200 μl槍頭做劃痕處理,按照1.3.4中分組方法并處理24 h,每組設置6個復孔,顯微鏡下觀察并記錄,ImageJ處理圖像,計算各組HUVEC平均愈合率。愈合率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.3.7Transwell實驗 收集1.3.2中HUVEC,接種于包被Matrigel基底膠的Transwell上室(5×106個/ml,200 μl),按照1.3.4中方法分組并處理,每組設置6個復孔,分別加入200 μl無血清ECM培養基。下室加入對應濃度的巴戟天含藥血清及200 μl ECM完全培養基,孵育24 h。取出小室,甲醛固定25 min,結晶紫染色20 min,風干,隨機選取6個視野,顯微鏡下觀察并計數。

1.3.8qRT-PCR實驗 參照Trizol說明書,提取1.3.4中各組細胞總RNA,并計算RNA純度(OD260 nm/OD280 nm)。反轉錄得cDNA。取2.5 μl cDNA模板,上下引物各1 μl,對各組HUVEC細胞FOXP2、AGGF1進行PCR擴增。PCR條件:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,62 ℃延伸30 s,共40次循環。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法分析目標基因表達情況。引物序列如下:FOXP2上游引物5′-TGGATGACCGAAGCACTGCTCA-3′,下游5′-TGGGAGATGGTTTGGGCTCTGA-3′;AGGF1上游引物5′-TGGTCCAACACTAAGTAAGGAGG-3′,下游5′-CCCTACGTTTTCCAGCTCTATCT-3′;GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAA-AAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.3.9Western印跡分析實驗 按照1.3.4中方法分組、鋪板并使用巴戟天含藥血清處理后,加入250 μl/孔RIPA裂解液低溫裂解30 min,離心收集上清。12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、封閉液封閉4 h,加入一抗FOXP2、AGGF1和GAPDH(1∶5 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,加入二抗(1∶10 000),TBST洗膜3次,ECL曝光顯影,觀察條帶并拍照記錄,Image-J處理圖片,以GAPDH為內參,計算FOXP2/GAPDH、AGGF1/GAPDH比值。

1.4統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析,進一步兩組間比較行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1高糖誘導對HUVEC增殖抑制作用 與對照組〔(97.48±2.11)%〕相比,高糖組(10、15、20、30、40 mmol/L)HUVEC存活率依次降低〔(97.48±2.11)%、(91.09±3.34)%、(84.27±2.23)%、(71.77±3.06)%、(51.69±2.47)%、(37.84±2.63)%,P<0.05〕。

2.2巴戟天含藥血清對HUVEC活性影響 與空白對照組和對照組相比,巴戟天低、中、高劑量組HUVEC存活率依次明顯升高(P<0.05),呈劑量依賴性。見表1。

表1 巴戟天含藥血清作用后各組HUVEC存活、凋亡、遷移及侵襲

2.3巴戟天含藥血清對HUVEC凋亡的影響 與空白對照組和對照組相比,巴戟天低、中、高劑量組HUVEC凋亡率依次明顯降低(P<0.05),呈劑量依賴性。見表1、圖1。

圖1 各組細胞凋亡

2.4巴戟天含藥血清對HUVEC遷移能力、侵襲數量的影響 與空白對照組和對照組相比,巴戟天低、中、高劑量組HUVEC劃痕愈合率、侵襲數量依次明顯升高(均P<0.05),呈劑量依賴性。見表1、圖2、圖3。

圖2 各組HUVEC遷移(×100)

圖3 巴戟天含藥血清對HUVEC侵襲能力的影響(結晶紫染色,×200)

2.5巴戟天含藥血清對HUVEC FOXP2及AGGF1表達的影響 與空白對照組和對照組相比,巴戟天低、中、高劑量組中FOXP2、AGGF1 mRNA及蛋白表達水平依次明顯升高(P<0.05),呈劑量依賴性。見表2、圖4。

1～5:空白對照組、對照組、巴戟天低劑量組、巴戟天中劑量組、巴戟天高劑量組圖4 Western印跡檢測各組HUVEC FOXP2、AGGF1蛋白表達

表2 各組FOXP2、AGGF1 mRNA及蛋白表達比較

3 討 論

在我國,DM發病率高達10.9%,居全球第一〔7〕。血管并發癥是導致DM患者死亡率高的首要原因,而血管內皮細胞損傷是血管并發癥的標志〔8〕。高糖狀態能夠抑制血管內皮細胞的增殖,并誘導凋亡,損傷血管內皮〔9〕,因此,減輕高糖誘導下血管內皮細胞的損傷作用是潛在的治療目標。本研究首先構建了高糖損傷模型,結果顯示,當D-葡萄糖濃度大于30 mmol/L,HUVEC損傷嚴重(存活率<50%),不利于后續研究,因此選擇30 mmol/L作為模擬高血糖損傷內皮細胞的最佳濃度。

巴戟天藥材來源于巴戟天干燥根,主要成分有寡糖、蒽醌、環烯醚萜等,在滋補腎陽方面具有良好的功效〔10〕。近年來,冉志芳等〔11〕研究發現,巴戟天能夠促進斑馬魚節間血管生成;另外,作為巴戟天主要活成物質之一,巴戟天糖鏈對血管內皮細胞的增殖、分化具有促進作用〔5〕;傅文生等〔12〕研究發現,巴戟天結合振動干擾,對治療Ⅱ型糖尿病大鼠具有積極作用。本研究結果提示,巴戟天含藥血清能夠促進血管內皮細胞增殖,抑制細胞凋亡,推測巴戟天可能對DM血管并發癥患者的血管內皮細胞具有保護作用。

血管內皮細胞轉移至其他部位是血管形成的關鍵,而促進血管內皮細胞的遷移侵襲功能有利于新血管形成〔13〕。Chen等〔14〕研究發現,高糖誘導后HUVEC的遷移能力明顯降低;王寧〔15〕研究證實,巴戟天糖鏈能夠提高缺氧/復氧誘導的HUVEC遷移能力;本研究結果提示,巴戟天含藥血清能夠促進高糖誘導下HUVEC的遷移能力,與上述研究結果一致。DM血管并發癥與血管內皮細胞增殖、凋亡及遷移關系密切相關〔16〕,因此推測,巴戟天可能是緩解DM血管并發癥潛在的有效中草藥之一。

FOXP2能夠促進腫瘤發生發展過程中的細胞遷移行為〔17,18〕。AGGF1是一種血管生成因子,正常狀態下在血管內皮細胞中高表達〔19〕。Zhang等〔20〕研究證實,AGGF1對體內生理性血管生成至關重要,與內皮細胞的增殖和遷移有關。本研究結果提示,巴戟天含藥血清促進HUVEC增殖及遷移,可能與激活FOXP2/AGGF1表達水平相關。Liu等〔21〕研究發現,激活FOXP2/AGGF1通路,對人微血管內皮細胞的增殖和遷移具有促進作用,與本研究結果一致,因此推測巴戟天可能通過激活FOXP2/AGGF1信號通路,促進高糖誘導下血管內皮細胞的增殖和遷移。

綜上,巴戟天含藥血清可促進HUVEC增殖、遷移、侵襲,并抑制細胞凋亡,可能與激活FOXP2/AGGF1信號通路相關,表明巴戟天在減緩DM血管并發癥方向具有潛在治療價值,可能為改善DM血管并發癥的治療效果提供了參考依據。但鑒于DM發病機制的復雜性及體外實驗與臨床疾病之間的巨大差異,本文將進一步聯合DM血管并發癥小鼠模型和臨床試驗,針對巴戟天調控機制及作用效果進行更深入的探索。