電針頭部運動區穴位對亞急性MPTP模型小鼠機械痛閾的干預

彭晶晶 朱本藩 李俊 李珊珊 朱四歡 肖順東 楊志來 許二赫

(1安徽中醫藥大學第一附屬醫院神經內科,安徽 合肥 230031;2安徽醫科大學第一附屬醫院疼痛科;3安徽中醫藥大學;4安徽醫科大學第一附屬醫院麻醉科;5首都醫科大學宣武醫院)

帕金森病(PD)通常表現為運動與非運動癥狀〔1〕。疼痛是PD臨床實踐中常被忽略的一種重要的非運動癥狀,可早于運動癥狀出現之前多年〔2〕,是PD早期階段的一個重要特征〔3〕。疼痛是PD的一種常見且日益公認的非運動癥狀,其患病率在 40%～85%,并隨著疾病進展而患病率增加〔4,5〕。臨床上通常把PD疼痛分為肌肉骨骼疼痛、肌張力障礙相關疼痛、神經根性疼痛、靜坐不能引起疼痛及原發性或中樞性PD疼痛〔6〕。PD的疼痛可能與運動癥狀的影響無關〔5,7〕,有研究認為PD疼痛的嚴重程度與運動并發癥、自主神經癥狀、焦慮和抑郁癥的嚴重程度存在微弱的相關性,而中樞敏化的特征明顯〔5〕。多巴胺能藥物可以部分患者改善癥狀〔5〕,提示多巴胺缺乏可能是PD相關疼痛發生的重要原因〔7〕。中醫針灸已逐漸被世界各國所接受〔8〕。頭針療法是通過針刺頭部的特定區域以治療各科疾病的一種微針系統療法。頭皮電針是在頭針針具上通接近人體生物電的微量低頻脈沖電流,利用針和電兩種刺激相結合治療疾病的方法,對各種疼痛療效明確〔9〕,被廣泛用于治療各種疼痛包括PD疼痛〔10〕,但目前電針改善PD疼痛的機制尚不清楚。本實驗擬通過1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)腹腔注射構建亞急性PD相關疼痛小鼠模型,觀察電針是否可以提高PD模型小鼠機械痛閾及可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料動物 實驗動物:雄性C57BL/6J小鼠30只,8周齡,SPF級,體質量18～25 g,購自杭州子源實驗動物科技有限公司,生產許可證號:SCXK(浙)2019-0004,動物合格證號:20220227Abzz-005000574。適應性飼養于安徽中醫藥大學第一附屬醫院動物房,飼養室溫度控制在(22±2)℃,12 h明暗交替,自由攝食飲水。實驗試劑:MPTP造模劑(Selleck),4%多聚甲醛(PFA),抗酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體(三鷹),舒泰50(Virbac),二甲苯(天津市凱通化學),無水乙醇(上海廣諾化學),檸檬酸鹽修復液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、過氧化物酶封閉液、抗小鼠/兔二步法檢測試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、蘇木素染液、中性樹膠(ebiogo)。實驗儀器:電子 Von Frey 壓力測痛儀,曠場實驗視頻分析系統Super Maze2.0, 低頻脈沖電子針灸治療儀(華佗牌),一次性無菌針灸針(0.25 mm×25 mm),生物組織自動脫水機、生物組織包埋機(湖北亞光),徠卡切片機、切片刀(Leica),電熱恒溫鼓風干燥箱、隔水式恒溫培養箱(上海三發),電磁爐(Midea),高壓鍋(SUPOR),PAP Pen 免疫組化筆、黏附載玻片(ebiogo),顯微鏡(OLYMPUS),自制爬桿,自制小鼠頭部固定器(已申請專利,專利號:CN202220053210.7)。

1.2實驗分組與造模 小鼠適應性喂養1 w后,隨機分為3組:對照組、模型組、電針組各10只。模型組和電針組按照30 mg/kg 劑量腹腔注射MPTP的方法建立PD小鼠模型,每日1次,連續5 d,對照組給予等體積生理鹽水。造模成功后,固定小鼠頭部,參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的動物針灸穴位圖譜和《實驗針灸學》〔11〕,選取焦氏頭針雙側運動皮層區域;用一次性無菌針灸針(0.25 mm×25 mm),向對側眼球方向進針,深度3 mm;電針參數:0.8～1.0 mA,疏密波,2/15 Hz,20 min,電流強度以小鼠安靜無躁動,耳郭輕度抖動或局部肌肉收縮為度。

1.3行為學測試 爬桿試驗:取一條長50 cm、直徑2 cm的纏有醫用紗布的木桿,作為實驗用爬桿。將裝置垂直放置,小鼠頭部向上輕輕放置于木桿頂部,觀察并記錄小鼠掉頭后從桿頂向下到雙前肢接觸桿底的時間,測3次取平均值。如果爬桿途中出現停滯或者反向攀爬則需重新測定。

曠場試驗:該實驗在安靜環境下進行。實驗前將小鼠放在實驗房間適應30 min,實驗時放置于曠場箱(50 cm×50 cm)中心,采用視頻追蹤系統觀察小鼠在5 min內的活動情況。觀察指標主要包括運動總路程和平均速度。每只小鼠觀察前,需清洗曠場箱內壁及底面,以避免上一個小鼠殘留的大小便及氣味的影響。

機械刺激傷害感受閾:將小鼠置于玻璃箱中30 min,底部為0.5 cm×0.5 cm 孔徑的鐵絲網。待小鼠安靜后,使用電子 von Frey 壓力測痛儀測定小鼠左足底跖側皮膚直至抬腿或主動縮足,測得機械縮足閾值(用 g 表示)。每只小鼠測定 3 次,每次相隔 5 min,取平均值。

1.4免疫組織化學法檢測小鼠黑質酪氨酸氫化酶(TH)的表達 實驗小鼠麻醉后開胸暴露心臟,PBS緩沖液心尖灌注,直至肺變成白色,停止灌注,完整取腦,PBS沖洗,放入4% PFA固定,生物組織包埋機包埋及連續腦組織冠狀切片,切片放入干燥箱66 ℃烤片20～30 min,依次過3道二甲苯,每道5 min,依次過3道(100%-95%-80%)乙醇,每道3 min ,將切片放入燒杯中,流水緩慢沖洗,洗去乙醇,直到切片干凈透明,在高壓鍋內配制2 000 ml pH為6.0的檸檬酸鹽修復液,電磁爐加熱至沸騰,放入切片蓋上鍋蓋,噴氣后計時2 min,然后停止加熱,流水緩慢沖洗高壓鍋蓋直至冷卻,切片放入3%H2O2中室溫孵育,蒸餾水洗3次,畫疏水圈,PBS-T沖洗3次,甩去切片上多余的液體,滴加二抗,加蓋置于37 ℃培養箱孵育30 min。取出切片,PBS-T沖洗3次,甩去切片上多余的液體,滴加DAB顯色劑,顯微鏡下控制顯色時間,有陽性終止顯色,蒸餾水沖洗干凈,蘇木素襯染2～5 min,水洗干凈;1%鹽酸酒精分化數秒,水洗干凈碳酸鋰溶液藍化30 s,水洗干凈,常規脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察結果。

1.5統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1電針對PD模型小鼠行為學的影響 在爬桿試驗中,與對照組〔(4.00±0.58)s〕相比,模型組爬桿總時間〔(5.25±1.25)s〕明顯延長(t=-2.719、P=0.015);與模型組比較,電針組爬桿總時間明顯縮短〔(3.62±0.91)s,t=3.161、P=0.006〕。在曠場試驗中,與對照組〔(24.26±4.65)m〕相比,模型組運動總路程〔(12.54±3.75)m〕明顯縮短(t=5.887、P<0.000 1),平均速度明顯減慢〔(0.08±0.02)m/s、(0.04±0.01)m/s,t=5.853、P<0.000 1〕;與模型組比較,電針組運動總路程較模型組明顯延長〔(17.53±3.80)m,t=-2.809、P=0.013〕,平均速度明顯提高〔(0.06±0.01)m/s,t=-2.978、P=0.009〕。

2.2電針對PD模型小鼠機械刺激傷害感受閾的影響 與對照組〔(3.10±0.21)g〕相比,模型組機械刺激傷害感受閾值明顯降低〔(2.18±0.31)g,t=7.409,P<0.000 1〕;與模型組相比,電針組機械刺激傷害感受閾值明顯升高〔(2.66±0.34)g,t=-3.180,P=0.006〕。

2.3電針對PD模型小鼠TH表達的影響 與對照組(0.79±0.01)比較,模型組TH表達顯著減少(0.16±0.04,t=31.087、P=0.001);與模型組比較,電針組TH表達顯著增多(0.33±0.08,t=-3.257、P=0.031)。見圖1。

圖1 3組腦黑質TH表達(SP染色,×200)

3 討 論

本研究結果表明,電針可以改善亞急性MPTP/PD疼痛模型小鼠的運動癥狀;電針可以提高亞急性MPTP/PD疼痛模型小鼠機械刺激傷害感受閾;電針可以減少亞急性MPTP/PD疼痛模型小鼠的多巴胺能神經元的凋亡。

目前電針在全球廣泛使用,可以緩解包括傷害性疼痛和神經病理性疼痛在內的各種疼痛〔12,13〕。其中,頭針鎮痛效果好且可持續一段時間〔9,13〕。既往臨床研究中已經證實,針刺對于PD疼痛有明顯的止痛作用〔14,15〕。動物研究表明電針可以逆轉因疼痛誘導而下調的酪氨酸羥化酶TH、多巴胺、D1和D2受體濃度,顯著降低坐骨神經慢性收縮性損傷誘導的疼痛(CCI)大鼠模型中杏仁核中的酸性蛋白GFAP、炎癥因子TNF-α和IL-1β,從而達到改善疼痛的目的〔12〕。電針可以調控敗血癥小鼠坐骨神經和迷走神經調節腎上腺中釋放多巴胺,由多巴胺抑制炎癥因子釋放,介導新的抗炎機制〔16〕。

PD中存在著參與疼痛處理結構的功能障礙,包括脊髓背角、中腦中央灰質、腦干傷害性下行抑制結構、基底節和皮層結構〔17〕。其中,基底神經節包括黑質、豆狀核、尾狀核及丘腦底核等結構,參與上行和下行中樞疼痛處理,多巴胺減少導致疼痛閾值降低〔18〕。基底節的疼痛輸入可能被認為來自兩個主要來源:(1)來自疼痛傳入系統的直接(例如,脊柱-基底節)和間接(如脊柱-丘腦-基底節)途徑;(2)來自皮質和皮質下腦區域〔19〕?；坠潓μ弁创碳さ膫魅肫鹫献饔谩?0〕。在蒼白球及丘腦底核等為靶點的深部腦刺激可以改善PD疼痛〔21,22〕。

既往的研究發現黑質毀損會引起PD模型小鼠的機械與熱痛敏反應升高,提示多巴胺缺乏導致痛覺過敏和疼痛,而紋狀體多巴胺能系統的激活在大鼠中具有鎮痛作用〔23～26〕。 MPTP及6-羥基多巴胺(OHDA)誘導的PD相關疼痛動物模型中均可發現疼痛閾值明顯降低,疼痛敏感性增強〔27,28〕,而在給予左旋多巴后這些動物模型的疼痛敏感性恢復,提示多巴胺可能參與疼痛的改善機制中〔28〕。在既往PD嚙齒動物模型中已經證實,針刺對多巴胺能神經元具有保護作用〔29〕。機制可能涉及多個靶點。大量動物實驗證實,針刺涉及多巴胺神經元線粒體功能障礙、氧化應激、蛋白質聚集、凋亡、自噬受損、腸道菌群和神經炎癥等多方面的調節〔29～31〕。

綜上,亞急性MPTP/PD疼痛小鼠模型中,電針可以通過抑制多巴胺神經元的凋亡,從而改善PD模型小鼠機械痛敏反應。說明多巴胺神經遞質仍然是PD相關疼痛改善的關鍵靶點,對PD相關疼痛的診斷和治療具有重要的指導作用。