右美托咪定介導GDNF表達對腦損傷大鼠神經元突觸損傷及肺功能保護機制

段彩萍 白江華 郝彬潔 韓云志 都義日

(鄂爾多斯市中心醫院,內蒙古 鄂爾多斯 017000)

創傷性腦損傷(TBI)的發病率、死亡率均較高,該病患者常出現惡心、嘔吐等癥狀,嚴重者會產生運動障礙〔1〕。膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)由M2型小膠質細胞(MG)分泌,可促進神經元再生,具有神經保護作用〔2〕。研究表明,GDNF在帕金森病〔3〕、神經病理性疼痛〔4〕等多種神經性疾病中均具有重要作用。在腦缺血再灌注中,通過促進GDNF的表達發揮神經保護作用〔5〕。在腦損傷中,肺損傷是其常見的并發癥。目前認為〔6〕,腦損傷繼發肺損傷與肺內過度炎癥反應導致肺血管及上皮細胞凋亡有關。中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的破壞性較大,是引起肺損傷的重要介質之一。目前對于治療TBI的神經保護類藥物較少,尋找促進神經元存活的藥物對治療TBI至關重要。右美托咪定(Dex)除具有抗炎作用外,還可改善神經元損傷。多項研究證實,其在腦出血〔7〕、腦卒中〔8〕等腦神經疾病中具有神經保護作用,另外,Dex還可減少由炎癥反應及氧化應激導致的細胞凋亡。但Dex對腦損傷神經功能等的具體作用機制尚未完全掌握,因此,本研究Dex介導GDNF表達對腦損傷大鼠神經元突觸損傷及肺功能保護機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 75只雄性SPF級SD大鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司〔許可證號:SCXK(蘇)2021-0102〕,鼠齡6～8 w,體質量200～300 g,適應飼養1 w后進行實驗。本實驗已通過醫院動物倫理委員會審批(批號:20190327)。

1.2實驗試劑 TUNEL工作液(武漢普健生物科技有限公司,貨號:ATK00001),NE、白細胞介素(IL)-8試劑盒(上海經科化學科技有限公司,貨號分別為SND-R812、CHM-009),蘇木素-伊紅(HE)染色液(金華力升實驗器材有限公司,貨號:002),突觸蛋白(SYN)1、腦源性神經營養因子(BDNF)一抗(上海滬震實業有限公司,貨號:hz883Ra21),辣根過氧化物酶二抗(北京博爾西科技有限公司,貨號:BHR112)。

1.3模型建立及干預 75只大鼠中隨機抽取15只作為健康組進行對照,剩余大鼠根據文獻〔9〕建立TBI模型:運用撞針撞擊左側腦皮層頂葉(3.5 mm/s,深2 mm),留針0.4 s,止血,封閉顱骨,縫合皮膚。以神經功能缺損評分為1～3分為建模成功。將模型大鼠隨機分為模型組、Dex組、GDNF組及聯合組,各組15只。健康組與模型組常規飼養,無任何處理;Dex 組于腹腔注射Dex 100 μg/kg;GDNF組于髓鞘注射2 μg GDNF ,1次/2 d,共2 w;聯合組在Dex組治療的基礎上給予GDNF組治療。

1.4檢測指標

1.4.1檢測Dex對各組神經功能缺損的影響 各組干預24 h、48 h、72 h后根據文獻〔10〕檢測神經功能缺損(mNSS) 狀況,主要由運動、感覺、反射測試構成,共18分,分值越高神經功能損傷越嚴重。

1.4.2Morris 水迷宮試驗評估Dex對各組認知功能的影響 空間學習能力:干預完畢后4次/d進行定位航行,將大鼠隨機放入水迷宮中,在大鼠找到平臺或航行120 s未找到平臺時結束,計算到達平臺的平均航行時間(逃避潛伏期),時間越長認知越差?？臻g探索:將水迷宮中平臺去除,水池中隨機位置放入大鼠,航行1 min,記錄穿越平臺次數,共2次,取均值。

1.4.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測Dex對各組肺損傷相關因子NE、白細胞介素(IL)-8水平表達的影響 支氣管肺泡灌洗液中NE、IL-8含量測定參照文獻〔11〕進行,從各組大鼠體內取支氣管肺泡灌洗液5～6 ml,采用ELISA檢測NE、IL-8水平,實驗按照說明書進行。

1.4.4HE染色觀察Dex對各組肺組織及腦組織病理形態的影響 取各組麻醉后處死,去除腦、肺組織,甲醛固定,自來水沖洗,脫蠟、包埋、切片。將各組肺、腦組織切片放入37 ℃復溫15 min,脫蠟、脫水后蘇木素染色10 min,鹽酸(1%)處理,伊紅復染,脫水,封片,觀察組織形態。

1.4.5TUNEL檢測Dex對各組腦組織神經細胞凋亡情的影響 取各組腦組織,石蠟切片脫蠟,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,加入TUNEL檢測液45 μl孵育1 h,PBS清洗,每張切片隨機選5個視野,計算凋亡率。細胞凋亡率(%)=凋亡細胞總數/(凋亡細胞總數+正常細胞總數)×100%。

1.4.6免疫印跡檢測Dex對各組SYN1、BDNF蛋白表達的影響 取各組腦組織,剪碎、裂解,離心后取上清,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉于PVDF膜上,脫脂奶粉封閉2 h后分別加入脫脂牛奶配制SYN1、BDNF一抗(1∶1 000)孵育過夜,加入辣根過氧化物酶二抗(1∶2 000)孵育1 h,PBS清洗,用化學發光液孵育 3 min 后曝光。應用 Image Pro Plus6.0(Media Cybernetics)軟件分析結果。

1.5統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行方差分析、t檢驗,多組內兩兩對比采用SNK-q法。

2 結 果

2.1Dex對各組神經功能缺損的影響 模型組不同時間mNSS評分明顯高于Dex組、GDNF組、聯合組(P<0.05),Dex組與GDNF組上述指標差異無統計學意義(P>0.05),聯合組不同時間mNSS評分明顯低于Dex組、GDNF組(P<0.05),見表1。

表1 各組mNSS評分對比分)

2.2Dex對各組認知功能的影響 與健康組相比,模型組逃避潛伏期明顯增加,穿越平臺次數明顯減少(P<0.05);與模型組相比,Dex組、GDNF組、聯合組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺次數明顯增加(P<0.05),Dex組、GDNF組各指標對比差異無統計學意義(P>0.05),與Dex組、GDNF組相比,聯合組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺次數明顯增加(P<0.05),見表2。

表2 各組水迷宮實驗指標水平對比

2.3Dex對各組肺損傷相關因子NE、IL-8水平表達的影響 健康組NE、IL-8水平明顯低于模型組(P<0.05),模型組NE、IL-8水平明顯高于Dex組、GDNF組、聯合組(P<0.05),Dex組、GDNF組各指標水平對比差異無統計學意義(P>0.05),Dex組、GDNF組NE、IL-8水平明顯高于聯合組(P<0.05),見表3。

表3 各組肺損傷相關因子NE、IL-8水平對比

2.4Dex對各組肺組織及腦組織病理形態的影響 肺組織:健康組肺組織正常;模型組可見肺泡腔及細支氣管內中性粒細胞和纖維蛋白滲出,肺泡隔增寬,肺泡萎陷,肺泡壁破裂,肺泡腔融合;與模型組肺組織相比,Dex組、GDNF組及聯合組肺組織均有所改善,且以聯合組效果最為顯著。腦組織:健康組腦組織正常;模型組腦組織發生水腫,神經元細胞核固縮;與模型組肺組織相比,Dex組、GDNF組及聯合組腦組織均有所改善,且以聯合組效果最為顯著,見圖1。

圖1 各組肺組織及腦組織病理形態(HE染色,×200)

2.5Dex對各組腦組織神經細胞凋亡的影響 健康組腦組織細神經細胞凋亡率〔(6.56±1.25)%〕明顯低于模型組〔(63.28±12.05)%,P<0.05〕,模型組細胞凋亡率明顯高于Dex組、GDNF組及聯合組〔(39.52±8.29)%、(39.56±8.32)%、(20.11±3.59)%,P<0.05〕,Dex組、GDNF組細胞凋亡率對比差異無統計學意義(P>0.05),聯合組細胞凋亡率明顯低于Dex組、GDNF組(P<0.05),見圖2。

圖2 各組神經細胞凋亡對比(TUNEL染色,×200)

2.6Dex對各組SYN1、BDNF蛋白表達的影響 健康組SYN1、BDNF表達明顯高于模型組(P<0.05),模型組SYN1、BDNF表達明顯低于Dex組、GDNF組及聯合組(均P<0.05),Dex組、GDNF組各指標對比差異無統計學意義(P>0.05),聯合組SYN1、BDNF表達明顯高于Dex組、GDNF組(P<0.05),見圖3、表4。

圖3 Dex對各組SYN1、BDNF蛋白表達的影響

表4 Dex 對各組SYN1、BDNF蛋白表達的影響

3 討 論

MG在中樞神經系統免疫防御中發揮著主要的免疫識別作用,對腦內微環境的維持和調節具有掌控作用。MG主要通過分泌BDNF、GDNF 發揮神經保護作用。研究發現〔12〕,GDNF成熟后在中樞神經系統的神經元、胼胝體、丘腦、小腦、海馬等中存在表達。GDNF可特異促進神經元生存,并對感覺/交感神經元具有保護作用。體外研究中〔13〕,在神經細胞混合培養中發現,若神經元在受到傷害性刺激后未死亡,接觸MG 后,通過促進GDNF的表達可促進神經元恢復。Yuan等〔14〕在運用電針干預缺血再灌注腦損傷大鼠的實驗中提出,通過調控TLR2/NF-κB通路,從而持續升高GDNF水平,改善神經功能缺損,發揮腦保護作用。以上研究提示GNDF水平與神經保護聯系密切。多項研究已經證實〔15,16〕,Dex對腦損傷的治療及神經保護的作用。陳金權等〔17〕提示,Dex可通過調控micoRNA-329-3p/CREB/IL-1RA通路恢復神經功能損傷及認知功能障礙,從而發揮腦保護的作用。另外,其還具有抑制全麻藥誘導的海馬神經元細胞凋亡,促進神經元存活的作用。曹艷等〔18〕在對創傷性腦損傷大鼠的實驗研究中提出,Dex可通過調控SIRT1通路抑制神經細胞的凋亡,從而減輕腦創傷后的繼發性損害。本研究提示,Dex可通過調控GDNF水平,發揮腦保護作用。

BDNF主要存在于腦皮質、海馬區等,可促進神經系統生長發育,促進神經元突觸形成、重塑,通過多種途徑減少神經元凋亡,是一種神經營養因子,還可促進神經元的生長。SYN1水平增加可鍍金突觸傳到、連接等,可恢復神經功能,其還參與神經遞質的傳遞釋放過程〔19〕。此外,SYN1是BDNF的下游因子,BDNF能夠促進SYN1含量增加,促進突觸重塑,恢復神經功能。在王冬慧等〔20〕對放射性腦損傷大鼠的實驗研究中運用電針進行干預后發現,通過調控Notch通路,促進SYN1、BDNF及突觸后致密蛋白95表達增加,修復了神經突觸損傷,提高了小鼠的學習記憶能力,從而改善腦損傷。在本研究結果提示,Dex通過促進BDNF、SYN1表達,修復損傷的神經突觸,保護神經功能,此外,本文神經功能缺損評分及認知功能結果也可證實上述結論。

顱腦損傷后由于昏迷、嘔吐等易發生口咽分泌物等誤吸入呼吸道,使得肺部受到感染,產生急性肺損傷,嚴重者會演變為呼吸窘迫綜合征。NE可降解多種蛋白(膠原蛋白、肺泡表面蛋白等),誘導炎性介質產生,上調細胞因子、黏附分子的表達,促進黏液分泌等功能,因此,被稱為急性肺損傷的終極效應因子。IL-8是氧自由基等產生的重要介質,是炎性因子之一,可趨化粒細胞進入炎癥區域。因此,肺內IL-8的增加在一定程度上反映了肺內炎癥反應和炎性損傷的程度。NE可促進IL-8的表達增加炎癥反應,IL-8可激活中性粒細胞從而增加NE含量,形成炎癥反應惡性循環,加重肺損傷。Dex具有抑制炎癥反應的作用。本研究結果提示,Dex干預后可通過降低IL-8、NE水平,減少肺部感染,預防呼吸窘迫綜合征的產生。

綜上,Dex通過促進GDNF表達,從而修復神經元突觸損傷,抑制神經元細胞凋亡,改善肺功能及認知功能,發揮腦保護及肺保護的作用。