群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控促進(jìn)大腸桿菌合成紅景天苷

沈玉平,賀茜,周紫微,何春蘭,張祖姣,3*

1(湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南 永州, 425199) 2(湖南南嶺地區(qū)植物資源研究開(kāi)發(fā)湖南省工程研究中心,湖南 永州,425199) 3(湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心,湖南 永州, 425199)

紅景天苷是傳統(tǒng)中藥紅景天(RhodiolaroseaL.)的主要藥理成分,具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤、美白和抗衰老等多重生理功效,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域,是一種極具應(yīng)用與開(kāi)發(fā)價(jià)值的高品質(zhì)天然產(chǎn)物[1]。植物提取是目前紅景天苷生產(chǎn)的主要方法,但紅景天資源日益稀缺,并且存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、含量低、提取工藝復(fù)雜等固有缺陷。雖然研究者后來(lái)開(kāi)發(fā)了人工種植、組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)等技術(shù),在一定程度上緩解了對(duì)紅景天資源的依賴,但仍未解決生長(zhǎng)周期長(zhǎng)和產(chǎn)量低的問(wèn)題[2-3]。隨著紅景天苷藥理機(jī)制和生理功效研究不斷深入,市場(chǎng)需求與日俱增,紅景天苷的生產(chǎn)面臨極大挑戰(zhàn)。

基于合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建工程菌發(fā)酵生產(chǎn)天然產(chǎn)物,是替代傳統(tǒng)植物提取法,實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物綠色、可持續(xù)生產(chǎn)的重要方法。目前,已有研究者通過(guò)改造模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母,實(shí)現(xiàn)了紅景天苷從頭合成(圖1)[4-5]。CHUNG等[4]和BAI等[5]通過(guò)優(yōu)選合成途徑關(guān)鍵酶[如醇脫氫酶和尿苷二磷酸(uridine diphosphate, UDP)-葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶]、阻斷競(jìng)爭(zhēng)途徑(如pheA、feaB)、解除反饋抑制(如敲除tyrR)等策略改造大腸桿菌,可產(chǎn)紅景天苷288、56.9 mg/L。基于相似的策略,JIANG等[6]改造釀酒酵母,搖瓶發(fā)酵,紅景天苷產(chǎn)量達(dá)到0.73 g/L。GUO等[7]在釀酒酵母中重構(gòu)中心代謝途徑,5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵可產(chǎn)紅景天苷1.82 g/L。LIU等[8]通過(guò)模塊工程改造釀酒酵母,5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵,紅景天苷產(chǎn)量達(dá)到26.55 g/L,這是目前微生物合成紅景天苷的最高水平。LIU等[9]將兩株改造的營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌進(jìn)行共培養(yǎng),5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵可產(chǎn)紅景天苷6.03 g/L。LIU等[10]在酪醇高產(chǎn)菌的基礎(chǔ)上,通過(guò)增加外源基因UGT85A1拷貝數(shù),5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵可產(chǎn)紅景天苷9.48 g/L,這是目前大腸桿菌合成紅景天苷的最高水平。

雖然目前紅景天苷合成水平得到大幅度提升,但與同一代謝途徑中酪氨酸(55 g/L)[11]的產(chǎn)量仍差距較大。同時(shí),作者在分析文獻(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),紅景天苷發(fā)酵菌體密度普遍偏低,并伴隨高濃度中間產(chǎn)物酪醇?xì)埩?如GUO等[7]利用釀酒酵母發(fā)酵紅景天苷,5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵,菌體密度僅為23.24 g DCW/L,紅景天苷1.82 g/L,而酪醇卻高達(dá)8.48 g/L;LIU等[9]和LIU等[10]利用大腸桿菌發(fā)酵紅景天苷,5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵OD600值均不超過(guò)40,LIU等[10]還發(fā)現(xiàn)紅景天苷工程菌OD600值較野生型大幅度下降。并且,CASADEY等[12]和本研究均發(fā)現(xiàn)酪醇具有良好的抑菌功能,GONZLEZ等[13]亦證實(shí)酪醇抑制細(xì)菌和酵母生長(zhǎng),影響細(xì)胞形態(tài)和生理狀態(tài)。此外,由于大腸桿菌缺乏對(duì)外源途徑的精確調(diào)控,因而無(wú)法充分發(fā)揮外源途徑的生物學(xué)功能,導(dǎo)致產(chǎn)物合成受阻。因此,酪醇對(duì)菌體的生長(zhǎng)抑制和外源途徑缺乏調(diào)控是限制紅景天苷產(chǎn)量進(jìn)一步提升的瓶頸。群體感應(yīng)(quorum-sensing, QS)是一種自誘導(dǎo)系統(tǒng),可根據(jù)細(xì)胞密度自動(dòng)調(diào)控基因的表達(dá),可較好地平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成,目前已成功提升大腸桿菌4-羥基苯乙酸[14]、肌醇和葡糖二酸[15]產(chǎn)量。因此,本研究以L值-多巴高產(chǎn)菌大腸桿菌(Escherichiacoli)DOPA 30N[16]為底盤(pán)細(xì)胞,通過(guò)篩選合成途徑關(guān)鍵酶、優(yōu)化底盤(pán)細(xì)胞和群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控等策略,緩解中間產(chǎn)物酪醇的毒性作用,平衡產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng),進(jìn)而提高紅景天苷合成水平。研究結(jié)果將有利于改變目前紅景天苷生產(chǎn)困境,并為其他糖苷類天然產(chǎn)物的微生物合成提供示范和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用質(zhì)粒和菌株請(qǐng)見(jiàn)附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035417,下同),引物請(qǐng)見(jiàn)附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035417,下同)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨,10;酵母提取物,5;NaCl,10;pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

SOC培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨20,酵母提取物5,葡萄糖3.6,KCl 0.186,NaCl 0.5,MgCl20.95,116 ℃滅菌20 min,用于電轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇。

LBGT培養(yǎng)基[16](g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,葡萄糖25,微量元素10 mL,pH 7.0～7.2,116 ℃滅菌20 min。微量元素(g/L):FeSO4·7H2O 10,ZnSO4·7H2O 2.2,MnSO4·4H2O 0.58,CuSO4·5H2O 1.0,Na2B4O7·10H2O 0.2,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1,35% HCl,10 mL,過(guò)濾除菌,接種前加入培養(yǎng)基。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖500,MgSO4·7H2O 30,116 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

限制性內(nèi)切酶,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;Prime Star Max DNA聚合酶,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,美基生物科技(廣州)有限公司;Gibson Assembly試劑盒,NEB(北京)有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所;抗生素,生工生物工程(上海)股份有限公司。L-酪氨酸、L-多巴、酪醇、4-羥基苯乙酸、紅景天苷和脫水四環(huán)素,百靈威科技(北京)有限公司;色譜級(jí)甲醇、三氟乙酸,安譜實(shí)驗(yàn)科技股份(上海)有限公司,其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、LC20-AT高效液相色譜,日本島津公司; 2 L×4 Minibox5 Intelli-Ferm平行生物反應(yīng)器,迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用酶切連接法和Gibson組裝法構(gòu)建質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR、酶切圖譜及測(cè)序正確后可使用。

酪醇合成途徑質(zhì)粒的構(gòu)建:分別PCR擴(kuò)增大腸桿菌(yqhD、yiaY、frmA、yjgB、yahk、adhP、aldB、adhE)和釀酒酵母的醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)基因(ADH6),插入到pBbB2K-GFP的EcoRⅠ/BamHⅠ間,獲得醇脫氫酶系列表達(dá)載體。隨后PCR擴(kuò)增ARO10F138L/D218G并去掉終止密碼子TAA,采用BglBrick組裝技術(shù)[17],插入到醇脫氫酶表達(dá)載體的EcoRI/BglⅡ間,使二者通過(guò)linker(GSG)2融合表達(dá)。

紅景天苷合成途徑質(zhì)粒構(gòu)建:通過(guò)Gibson組裝法構(gòu)建。庫(kù)葉紅景天(Rhodiolasachalinensis)來(lái)源UGT73B6(GeneBanK號(hào):AY547304)和UGT72B14(GeneBanK號(hào):EU567325),擬蘭芥(Arabidopsisthaliana)來(lái)源UGT85A1(GeneBanK號(hào):At1 g22400),以及地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)來(lái)源UGT1(GeneBanK號(hào):AAU40842)均經(jīng)密碼子優(yōu)化后由金唯智(蘇州)生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成。設(shè)計(jì)引物去掉yahK終止密碼子,PCR擴(kuò)增pBbB2K-ARO10F138L/D218G-L-yahK整個(gè)質(zhì)粒以及UGT73B6、UGT72B14、UGT85A1和UGT1,瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物后,按照Gibson Assembly試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,構(gòu)建ARO10F138L/D218G-L-yahK分別與UGT73B6、UGT72B14、UGT85A1、UGT1融合表達(dá)的紅景天苷合成途徑質(zhì)粒。

sgRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建:采用反向PCR構(gòu)建feaB敲除及pgm、galU啟動(dòng)子置換所需sgRNA表達(dá)質(zhì)粒。

群體感應(yīng)調(diào)控紅景天苷合成途徑質(zhì)粒構(gòu)建:以pBbB2k-ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1和pZBK-PesaSIC-PesaRAS為模板,分別PCR擴(kuò)增ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1和群體感應(yīng)質(zhì)粒骨架,純化PCR產(chǎn)物,按照Gibson Assembly試劑盒說(shuō)明書(shū),構(gòu)建群體感應(yīng)調(diào)控紅景天苷合成途徑質(zhì)粒pZBK-PesaRAS-SL。

1.3.2 基因編輯

feaB基因敲除和P37置換pgm、galU天然啟動(dòng)子,均參照J(rèn)IANG等[18]報(bào)道的方法,采用CRISPR/Cas9技術(shù),通過(guò)同源重組的方法進(jìn)行。

1.3.3 工程菌發(fā)酵

種子培養(yǎng):挑取活化的單菌落接種至含20 mL LB培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。

搖瓶發(fā)酵:測(cè)定種子液OD600值,按照初始OD600=0.1的接種量接種至裝有50 mL LBGT培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定生物量(OD600值)、酪醇和紅景天苷濃度。

發(fā)酵罐發(fā)酵:采用分批補(bǔ)料發(fā)酵的方式,在2 L×4平行發(fā)酵罐上執(zhí)行,裝液量1.2 L,以初始OD600值 0.2 左右的接種量接種,通氣量1.8 L/min,發(fā)酵溫度30 ℃,以氨水調(diào)節(jié)pH值恒定在7.0(死區(qū)0.1),攪拌轉(zhuǎn)速400～1 200 r/min,溶氧設(shè)定為25%(死區(qū)5%)并與轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制,初始葡萄糖質(zhì)量濃度設(shè)置為5 g/L,采用pH-stat補(bǔ)料策略,每隔4 h取樣測(cè)定OD600值、葡萄糖濃度、酪醇和紅景天苷產(chǎn)量。

含有質(zhì)粒的工程菌,按照要求加入相應(yīng)濃度的抗生素。需要誘導(dǎo)表達(dá)的菌株,OD600值達(dá)到2.5時(shí)加入脫水四環(huán)素(工作質(zhì)量濃度120 ng/mL)誘導(dǎo)。

1.3.4 酪醇和紅景天苷檢測(cè)

參照作者[14]前期分析4-羥基苯乙酸的方法,利用HPLC檢測(cè)紅景天苷和酪醇。取發(fā)酵液2 mL,10 000 r/min離心1 min,上清液0.22 μm濾膜過(guò)濾,收集濾液檢測(cè)。分析條件:LC20-AT HPLC檢測(cè)系統(tǒng),Inertsil ODS-SP C18反相柱(GL Inertsil ODS-SP 150 mm×4.6 mm,5 μm),SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器,流動(dòng)相A為0.2%三氟乙酸,流動(dòng)相B為100%甲醇,柱溫30 ℃,進(jìn)樣體積10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm,采用梯度洗脫法檢測(cè)。分析程序:0～20 min甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)由14%梯度上升至45%,隨后下降至14%直至30 min結(jié)束,流速0.5 mL/min。在此條件下,紅景天苷、酪醇、L-酪氨酸、L-多巴和4-羥基苯乙酸可很好地分離開(kāi)來(lái)(圖2-a),發(fā)酵液中酪醇(圖2-b)和紅景天苷(圖2-c)保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致。

a- 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖;b- 酪醇工程菌TR5發(fā)酵液液相色譜圖;c- 紅景天苷工程菌SL3發(fā)酵液液相色譜圖圖2 HPLC分析紅景天苷、酪醇標(biāo)準(zhǔn)品和工程菌發(fā)酵液的色譜圖Fig.2 HPLC analysis of standard tyrosol, standard salidroside and fermentation broth of engineered E.coli

1.3.5 酪醇對(duì)底盤(pán)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

挑取活化的SLP單菌落,接種至含20 mL LB培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h,以初始OD600=0.1的接種量,分別接種至酪醇質(zhì)量濃度0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 g/L的5 mL LB試管中,培養(yǎng)12 h后測(cè)量OD600值,考察不同濃度酪醇對(duì)底盤(pán)細(xì)胞SLP生長(zhǎng)的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù),數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式呈現(xiàn),采用SPSS 26.0進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn),P<0.05定義為具有顯著性,P<0.01定義為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天苷合成途徑篩選

2.1.1 酪醇合成途徑篩選

酪醇與UDP-葡萄糖是合成紅景天苷的直接前體物,4-羥基苯乙醛則是合成酪醇的直接前體物。基于不同的4-羥基苯乙醛合成方式,大腸桿菌中構(gòu)建的人工酪醇合成途徑有3條,即苯丙酮酸脫羧酶(如ARO10和IpdC)-醇脫氫酶途徑[19-21]、芳香醛合成酶(如AAS)-醇脫氫酶途徑[4, 22]和酪氨酸脫羧酶(如TydC、AspC和HisC)-酪胺氧化酶(如TynA和TYO)-醇脫氫酶[23]途徑。作者[14]前期對(duì)比了3條4-羥基苯乙醛合成途徑,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母來(lái)源的苯丙酮酸脫羧酶ARO10效率最高,并通過(guò)定向進(jìn)化獲得了催化效率大幅度提高的突變體ARO10F138L/D218G。以此為基礎(chǔ),將其與不同來(lái)源的醇脫氫酶融合表達(dá),導(dǎo)入L-多巴高產(chǎn)菌DP中,以僅表達(dá)ARO10F138L/D218G的質(zhì)粒為對(duì)照,發(fā)酵考察其對(duì)酪醇合成的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)醇脫氫酶基因?qū)掖己铣傻挠绊慒ig.3 Effects of overexpression of alcohol dehydrogenase genes on the tyrosol production

由圖3可知,僅表達(dá)ARO10F138L/D218G亦可合成酪醇,說(shuō)明內(nèi)源醇脫氫酶可催化4-羥基苯乙醛生成酪醇,LIU等[9]、YANG等[24]和薛宇翔等[25]在酪醇合成研究中也證實(shí)了這一結(jié)論。過(guò)量表達(dá)醇脫氫酶,除frmA和adhP之外,可提高酪醇產(chǎn)量12.70%～57.98%,yahK效果最佳,達(dá)到(1 086.1±52.3) mg/L。但是,LIU等[9]研究結(jié)果顯示,大腸桿菌內(nèi)源醇脫氫酶足以飽和底物,過(guò)表達(dá)反而導(dǎo)致酪醇產(chǎn)量降低。酪醇與L-多巴均為酪氨酸衍生物,本研究出發(fā)菌株DP為L(zhǎng)-多巴高產(chǎn)菌,對(duì)糖酵解、磷酸戊糖和莽草酸途徑進(jìn)行過(guò)多處遺傳修飾和改造,并且進(jìn)化后的突變體ARO10F138L/D218G催化效率大幅度提升,因而提高了代謝通量,使得內(nèi)源醇脫氫酶不能充分飽和底物。LI等[20]和曾嬌嬌等[22]在大腸桿菌酪醇合成研究中發(fā)現(xiàn),部分醇脫氫酶基因過(guò)表達(dá)后會(huì)導(dǎo)致酪醇產(chǎn)量降低,本研究中過(guò)表達(dá)frmA和adhP亦導(dǎo)致酪醇產(chǎn)量下降,其原因尚需設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

2.1.2 紅景天苷合成途徑篩選

尿苷二磷酸葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate glucosyltransferase, UGT)是紅景天苷合成的關(guān)鍵酶。研究顯示,庫(kù)葉紅景天來(lái)源的UGT73B6[26]和UGT72B14[27],擬蘭芥來(lái)源的UGT85A1[4,9-10]和地衣芽孢桿菌來(lái)源的UGT1[28]均可催化酪醇形成紅景天苷,因此我們將上述4個(gè)UGT與最優(yōu)酪醇合成途徑ARO10F138L/D218G-L-yahK融合表達(dá),考察其對(duì)紅景天苷合成的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)UGT基因?qū)t景天苷合成的影響Fig.4 Effects of overexpression of UGT genes on the salidroside production

由圖4可知,4個(gè)UGT均可催化酪醇生成紅景天苷,UGT85A1催化效率最高,可產(chǎn)紅景天苷(605.8±16.8) mg/L。YU等[27]通過(guò)大腸桿菌異源表達(dá)UGT72B14和UGT73B6,并進(jìn)行了純化和表征,結(jié)果顯示UGT72B14催化效率較UGT73B6高出170%。FAN等[28]體外催化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,UGT1催化效率優(yōu)于UGT73B6。LIU等[9]研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌中UGT85A1紅景天苷產(chǎn)量遠(yuǎn)高于UGT1。CHUNG等[4]比較了12個(gè)擬蘭芥來(lái)源的UGT,發(fā)現(xiàn)UGT85A1紅景天苷合成效率最高。本研究系統(tǒng)比較了4個(gè)UGT在大腸桿菌中的紅景天苷合成效率,發(fā)現(xiàn)UGT85A1最高,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用UGT85A1。

2.2 優(yōu)化底盤(pán)細(xì)胞提高紅景天苷產(chǎn)量

UDP-葡萄糖和酪醇是合成紅景天苷的直接前體物,二者充足和均衡的供給是紅景天苷高效合成的關(guān)鍵。由圖1分析可知,敲除feaB可阻斷4-羥基苯乙酸合成途徑,使代謝流轉(zhuǎn)向酪醇的合成;強(qiáng)化表達(dá)pgm和galU有利于提高UDP-葡萄糖的供給。為此,敲除DP的feaB基因,以P37啟動(dòng)子置換pgm和galU天然啟動(dòng)子PseqA和PgalU,同時(shí)以高翻譯效率UTR序列“TTTCGGAATTAAGGAGGTAATAAAT”置換其天然5′-UTR,以強(qiáng)化表達(dá)pgm和galU,獲得菌株SLP。將最優(yōu)紅景天苷合成途徑質(zhì)粒pBbB2K-ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1引入至SLP,獲得菌株SLP3,發(fā)酵考察其對(duì)紅景天苷合成的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 優(yōu)化底盤(pán)細(xì)胞對(duì)紅景天苷合成的影響Fig.5 Effect of engineering of chassis cell on the production of salidroside注:*表示顯著(P<0.05);**表示極顯著(P<0.05)(下同)

由圖5可知,底盤(pán)細(xì)胞優(yōu)化后,紅景天苷產(chǎn)量和酪醇產(chǎn)量均極顯著提高(P<0.01),達(dá)到(1 156.3±44.2) mg/L,較對(duì)照SL3提高95.03%,說(shuō)明敲除feaB,強(qiáng)化表達(dá)pgm、galU提高前體物供給的策略可有效地提高紅景天苷產(chǎn)量。敲除feaB,可阻斷4-羥基苯乙酸競(jìng)爭(zhēng)途徑,促進(jìn)前體物酪醇的合成,這在CHUNG等[4]、薛宇翔等[25]和YANG等[29]的研究也證實(shí)了這一結(jié)論。同時(shí),發(fā)酵液中酪醇比例亦極顯著下降(P<0.01),由53.19%降低至42.19%,說(shuō)明強(qiáng)化表達(dá)pgm、galU增大了UDP-葡萄糖的供給,將酪醇轉(zhuǎn)化為紅景天苷。但在SLP3發(fā)酵液中,仍有(842.4±22.7) mg/L酪醇?xì)埩?且OD600值亦低于正常水平,可能是酪醇對(duì)底盤(pán)細(xì)胞的毒性作用,代謝產(chǎn)物的積累以及質(zhì)粒高表達(dá)造成的代謝負(fù)擔(dān),導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制,進(jìn)而影響紅景天苷的合成。

2.3 群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)紅景天苷合成的影響

2.3.1 酪醇對(duì)底盤(pán)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

CASADEY等[12]發(fā)現(xiàn)酪醇具有良好的抑菌功能,GONZLEZ等[13]發(fā)現(xiàn)酪醇可影響細(xì)菌和酵母的細(xì)胞形態(tài)和生理狀態(tài)。此外,在大腸桿菌和釀酒酵母紅景天苷合成研究中,均發(fā)現(xiàn)菌體發(fā)酵密度低于正常水平[6-7,9-10]。為此,考察了酪醇對(duì)底盤(pán)細(xì)胞SLP的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 酪醇對(duì)底盤(pán)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of tyrosol on the growth of chassis cell

由圖6可知,酪醇強(qiáng)烈抑制底盤(pán)細(xì)胞SLP生長(zhǎng),2 g/L 抑制率達(dá)33.5%,而8 g/L則幾乎完全抑制菌體生長(zhǎng)。此外,全細(xì)胞生物催化的酪醇產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率均遠(yuǎn)高于從頭合成[28-29],這也間接證實(shí)了酪醇對(duì)細(xì)胞的毒性作用。因此,減少中間產(chǎn)物酪醇積累,解除其毒性作用,是進(jìn)一步提升紅景天苷產(chǎn)量的關(guān)鍵。

2.3.2 群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)紅景天苷合成的影響

群體感應(yīng)是一種細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊系統(tǒng),可依據(jù)細(xì)胞密度自動(dòng)調(diào)控基因表達(dá)。作者前期構(gòu)建了一個(gè)兼具激活和抑制功能的群體感應(yīng)質(zhì)粒pZBK-PesaSIC-PesaRAS(圖7-a),可以同時(shí)調(diào)控競(jìng)爭(zhēng)途徑和合成途徑[14]。以群體感應(yīng)激活啟動(dòng)子PesaR控制紅景天苷合成途徑ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1,可動(dòng)態(tài)激活合成途徑的表達(dá)。早期細(xì)胞密度低時(shí),合成途徑的表達(dá)受到限制,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),隨著細(xì)胞密度的增大,逐步增強(qiáng)合成途徑的表達(dá),以此實(shí)現(xiàn)群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控,從而減輕中間產(chǎn)物酪醇對(duì)細(xì)胞的毒性作用,緩解紅景天苷積累和質(zhì)粒高表達(dá)造成的代謝負(fù)擔(dān),平衡細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成。將紅景天苷群體感應(yīng)調(diào)控質(zhì)粒pZBK-PesaRAS-SL(圖7-b)引入底盤(pán)細(xì)胞SLP,獲得工程菌SLPQ3,發(fā)酵考察其對(duì)紅景天苷合成的影響。圖7-c發(fā)酵結(jié)果顯示,SLPQ3的紅景天苷產(chǎn)量和OD600值較對(duì)照SLP3極顯著提高(P<0.01),紅景天苷產(chǎn)量達(dá)到(1 484.6±21.4) mg/L,OD600值達(dá)到8.18±0.23,較靜態(tài)誘導(dǎo)表達(dá)工程菌SLP3分別提高36.3%和31.6%。此外,發(fā)酵液酪醇比例亦極顯著下降(P<0.01),由44.4%下降至30.3%,說(shuō)明群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)在一定程度上可降低酪醇積累,減輕毒性作用,緩解生長(zhǎng)抑制,進(jìn)而提高紅景天苷產(chǎn)量。作者在前期研究中,通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)調(diào)控4-羥基苯乙酸合成途徑,使其產(chǎn)量提高了46.4%[14]。這證實(shí)群體感應(yīng)系統(tǒng)作為一種自誘導(dǎo)系統(tǒng),可以減輕產(chǎn)物或中間產(chǎn)物對(duì)底盤(pán)細(xì)胞的毒性作用,較好的平衡生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成,這對(duì)高毒性化學(xué)品和其他糖苷類天然產(chǎn)物的生物合成具有廣泛的借鑒和應(yīng)用價(jià)值。

a-群體感應(yīng)調(diào)控質(zhì)粒;b-群體感應(yīng)調(diào)控紅景天苷合成途徑質(zhì)粒;c-群體感應(yīng)調(diào)控紅景天苷合成途徑發(fā)酵結(jié)果圖7 群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)紅景天苷合成的影響Fig.7 Effect of dynamic quorum-sensing control of salidroside synthesis pathway on the production of salidroside注:pZBK-PesaSIC-PesaRAS工作機(jī)制。在沒(méi)有esaI合成的群體感應(yīng)信號(hào)分子AHL存在時(shí),esaRI70V編碼的轉(zhuǎn)錄因子EsaRI70V可以與啟動(dòng)子PesaS結(jié)合而激活下游基因(MCS1位點(diǎn))的轉(zhuǎn)錄,同樣EsaRI70V可以與啟動(dòng)子PesaR結(jié)合抑制下游基因(MCS2位點(diǎn))的表達(dá)。隨著細(xì)胞生長(zhǎng),開(kāi)始積累信號(hào)分子AHL,AHL與轉(zhuǎn)錄因子EsaRI70V結(jié)合,導(dǎo)致EsaRI70V與啟動(dòng)子PesaS解離,抑制其下游基因(MCS1位點(diǎn))的表達(dá),同時(shí)使EsaRI70V與啟動(dòng)子PesaR解離,激活其下游基因(MCS2位點(diǎn))的表達(dá)。由于群體感應(yīng)信號(hào)分子AHL數(shù)量與細(xì)胞密度相關(guān),因此群體感應(yīng)裝置的激活和抑制均隨細(xì)胞密度呈動(dòng)態(tài)變化,細(xì)胞密度大,其激活和抑制越強(qiáng)

2.4 2 L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)紅景天苷

在群體感應(yīng)激活系統(tǒng)中,基因表達(dá)強(qiáng)度隨細(xì)胞密度的增大而增加,為進(jìn)一步驗(yàn)證群體感應(yīng)調(diào)控工程菌SLPQ3的紅景天苷生產(chǎn)潛力,在2 L平行生物反應(yīng)器系統(tǒng)中同時(shí)對(duì)SLP3和SLPQ3進(jìn)行發(fā)酵。圖8發(fā)酵結(jié)果顯示,群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控工程菌SLPQ3最大OD600值達(dá)到46.74,較對(duì)照SLP3提高26.6%(P<0.01);紅景天苷產(chǎn)量達(dá)到4.38 g/L,較SLP3提高48.2%(P<0.01);此外,發(fā)酵液中酪醇比例由33.67%降至17.86%(P<0.01),展現(xiàn)了良好的生產(chǎn)潛力。

圖8 群體感應(yīng)調(diào)控菌株SLPQ3分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果Fig.8 Fed-batch fermentation of strain SLPQ3 with dynamic quorum-sensing control of salidroside synthesis pathway

3 討論

紅景天苷是一種高品質(zhì)天然產(chǎn)物,極具應(yīng)用與開(kāi)發(fā)價(jià)值。本研究在前期研究獲得的苯丙酮酸脫羧酶突變體ARO10F138L/D218G基礎(chǔ)上,通過(guò)篩選醇脫氫酶和UDP-葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶,紅景天苷產(chǎn)量達(dá)到(605.8±16.8) mg/L;通過(guò)敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因feaB,強(qiáng)化表達(dá)UDP-葡萄糖合成的關(guān)鍵基因pgm和galU,紅景天苷產(chǎn)量提高95.03%,達(dá)到(1 156.3±44.2) mg/L。采用群體感應(yīng)激活系統(tǒng)動(dòng)態(tài)調(diào)控紅景天苷合成途徑,有效地減輕了酪醇的毒性作用,緩解了生長(zhǎng)抑制,搖瓶發(fā)酵OD600值達(dá)到8.18±0.23,紅景天苷產(chǎn)量達(dá)(1 484.6±21.4) mg/L,較對(duì)照SL3分別提升36.3%和32.6%。2 L發(fā)酵罐水平發(fā)酵,紅景天苷產(chǎn)量達(dá)到4.38 g/L,OD600值達(dá)到46.74,分別較靜態(tài)誘導(dǎo)表達(dá)提高48.2%和26.6%,展現(xiàn)了良好的生產(chǎn)能力。

本研究通過(guò)不同的策略逐步提高了紅景天苷產(chǎn)量,但仍有較高濃度中間產(chǎn)物酪醇?xì)埩?且菌體發(fā)酵密度也未達(dá)到正常水平,這說(shuō)明群體感應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控雖可減輕酪醇毒性作用,緩解生長(zhǎng)抑制,但并不能達(dá)到完全消除的目的。適應(yīng)性進(jìn)化可在不需要任何遺傳調(diào)控信息的條件下,快速提高細(xì)胞的耐受性[30],因此后續(xù)可通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化提高底盤(pán)細(xì)胞的酪醇耐受性。此外,還可對(duì)外源酶UGT85A1定向進(jìn)化提高酶活力,將積累的酪醇轉(zhuǎn)化為紅景天苷,也可通過(guò)可調(diào)控基因間隔區(qū)(TIGR)、SpyCatcher-SpyTag等底物通道平衡基因表達(dá),減少中間產(chǎn)物酪醇積累。紅景天苷合成需要大量NADPH和ATP,目前已有大量輔因子改造提高產(chǎn)物合成效率的案例[31-32],因此可考慮重構(gòu)NADPH合成途徑或CRISPRi抑制NADPH和ATP消耗相關(guān)基因,提高NADPH和ATP供給,促進(jìn)紅景天苷合成。在本研究中,紅景天苷搖瓶發(fā)酵水平為(1 484.6±21.4) mg/L,與LIU等[9]大腸桿菌(1 072.46 mg/L)以及LIU等[8]釀酒酵母(1 575.45 mg/L)的搖瓶發(fā)酵水平相近,但本研究發(fā)酵罐發(fā)酵水平僅為4.38 g/L,與他們(6.03 g/L)[9]和(26.55 g/L)[8]的發(fā)酵罐發(fā)酵水平存在較大差距,因此后續(xù)可通過(guò)改變發(fā)酵策略和優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)一步釋放菌株生產(chǎn)潛力。