重組地衣芽孢桿菌全細胞轉化產(R)-檸蘋酸的研究

沈佳穎,李由然,石貴陽*

1(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

(R)-檸蘋酸 (R-citramalate) 是一種五碳羥基二羧酸,廣泛存在于某些細菌的代謝途徑當中,例如,詹式甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)[1]、硫還原地桿菌(Geobactersulfurreducens)、黃桿菌(Chlorobaculumtepidum)中異亮氨酸的生物合成途徑;破傷風梭菌(Clostridiumtetanomorphum)中谷氨酸的厭氧代謝等,均涉及(R)-檸蘋酸的合成[2-4]。(R)-檸蘋酸是重要的多功能有機酸,其作為聚合物中間體甲基丙烯酸(methacrylic acid,MAA)的化學合成前體[5-7],不僅可以用于樹脂生產工業[8-10],而且可以作為酸化劑、除皺劑在食品加工、美容、醫療等領域發揮重要作用[11-13]。因此,(R)-檸蘋酸具有廣闊的應用和市場前景。

檸蘋酸的合成方法主要為化學法,以氰化氫和乙基乙酰酯為底物通過縮合反應合成[13]。但是,由于前體物質的毒性及其所帶來的高成本等問題,難以滿足可持續發展的需求,極大限制了該方法的應用。近些年來,隨著合成生物學的發展,檸蘋酸的生物合成已經成為了更具吸引力的替代方案:以丙酮酸和乙酰-CoA為前體物質,在檸蘋酸合酶的催化下特異性縮合形成檸蘋酸[14](圖1)。PARIMI等[15]、WU等[16]在大腸桿菌(Escherichiacoli)中異源表達檸蘋酸合酶——CimA3.7(該酶來源于詹式甲烷球菌[1],是由ATSUMI等[17]經過篩選和定向進化后得到的穩定性更高的酶),由此成功引入檸蘋酸合成途徑,得到高產檸蘋酸的重組大腸桿菌菌株。該研究以葡萄糖為底物,最終在搖瓶發酵水平產生2.9 g/L檸蘋酸[15]。雖然大腸桿菌遺傳操作簡單,但在工業化發酵過程中,其噬菌體侵染的問題仍缺乏有效的解決策略[18];再者,對于利用重組大腸桿菌生產檸蘋酸的過程,由于大腸桿菌對底物葡萄糖的耐受性以及產物積累造成環境pH值降低而導致細胞生長代謝受損,不利于高濃度檸蘋酸的積累[19-20]。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)屬于厚壁菌門,可在酸性、高溫、營養匱乏等不利的外界環境中以芽孢的形式存在,具有抗逆性強、酶系豐富等眾多的優勢,是理想的外源基因表達宿主[21],因此,有關地衣芽孢桿菌檸蘋酸合成途徑的構建及優化有很大的研究價值。

圖1 地衣芽孢桿菌中檸蘋酸合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of citramalate in Bacillus licheniformis注:cimA(檸蘋酸合酶);gltA(檸檬酸合酶);PEP(磷酸烯醇式丙酮酸,phosphoenolpyruvate);TCA(三羧酸循環,tricarboxylic acid cycle)

目前,有關檸蘋酸生物生產的研究主要集中于傳統發酵法,尚未提出利用全細胞轉化這一生產工藝進行產物合成。與發酵法相比,高菌體濃度(OD600值)條件下的全細胞轉化法憑借著副產物少、產率高等眾多優勢被廣泛應用。當菌體處于高密度的環境中時,生長受到限制從而更多的用于細胞轉化;此外,全細胞轉化過程中,完整的細胞體保護胞內酶不受外界條件的影響,比游離酶更穩定,從而使轉化能夠發生在高溫、低pH等較惡劣的環境中。如通過高密度培養大腸桿菌表達4-羥基苯乙酸酯3-羥化酶并進行全細胞催化香豆酸高效生產咖啡酸,使得咖啡酸的最終產量可達到18.74 g/L[22];采用重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為工程菌株全細胞轉化生產N-乙酰神經氨酸可達到93.78 g/L[23]。研究表明微生物體內的乙酰-CoA作為檸檬酸與檸蘋酸的前體,主要與草酰乙酸縮合形成檸檬酸進入三羧酸循環而用于細胞生長[16],使得檸蘋酸合成的代謝流受到抑制。由此,首次提出重組地衣芽孢桿菌全細胞轉化合成檸蘋酸的研究,在限制生長的基礎上有效減少三羧酸循環的代謝流以增加檸蘋酸產量。

本研究首次以地衣芽孢桿菌作為底盤細胞,引入異源檸蘋酸合酶搭建了檸蘋酸合成途徑,以葡萄糖為底物實現了檸蘋酸的合成與積累,將地衣芽孢桿菌全細胞轉化系統應用于檸蘋酸的合成,通過優化重組菌株全細胞轉化產檸蘋酸的條件,以提高其產量及轉化率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本研究中使用的菌株、質粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑與儀器

(R)-檸蘋酸標準樣品、氨芐青霉素、四環素,美國Sigma公司;2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)、DNA提取、純化、凝膠回收試劑盒均,南京諾唯贊生物科技有限公司;2×Rapid Taq PCR Master Mix、T4 DNA連接酶、限制性核酸內切酶,美國Thermo Fisher公司;棉籽蛋白,北京鴻潤寶順科技有限公司。

HYL-C組合式搖床,太倉市實驗設備廠;可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;CF16RXⅡ型冷凍離心機,日本HITACHI公司;DYY-6C核酸電泳儀,北京六一廠;Sonics VCX-750型超聲波細胞破碎儀,美國Sonics公司;DIONEX Ulitimate U3000液相色譜儀,美國賽默飛Thermo公司。

1.1.3 培養基與培養條件

(1)LB培養基(g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10(固體培養基加15 g/L的瓊脂粉)。

(2)CMA發酵培養基(g/L):蛋白胨FP321 20、酵母粉FM408 10、葡萄糖100、玉米漿干粉5、K2HPO4·3H2O 9.12、KH2PO41.36、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 0.5、(NH4)2HPO410[24]。

(3)CMB發酵培養基(g/L):蛋白胨FP321 20、酵母粉FM408 10、葡萄糖200、玉米漿干粉5、K2HPO4·3H2O 9.12、KH2PO41.36、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 0.5、(NH4)2HPO410。

(4)CMC發酵培養基(g/L):蔗糖100、棉籽蛋白30、K2HPO4·3H2O 9.12、KH2PO41.36、(NH4)2HPO410(pH 7.5)[25]。

(5)TB轉化培養基(g/L):蛋白胨12、酵母粉24、K2HPO412.54、KH2PO42.31、甘油5(pH 7.0)。

上述培養基所添加的氨芐青霉素或四環素的終質量濃度分別為100、20 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒的構建

參照ATSUMI等[17]關于檸蘋酸合酶基因(cimA)的突變結果,得到穩定性更好的檸蘋酸合酶——CimA3.7,按照地衣芽孢桿菌密碼子偏好性優化合成該基因,以其為模板,使用正向引物CimA-F和反向引物CimA-R進行PCR擴增,并純化回收得到目的片段cimA3.7。以質粒pEG(本實驗室保藏)為模板,使用正向引物pHY-S09-F和反向引物pHY-S09-R反向PCR擴增得到表達載體pHY-Pshuttle09。引物的兩端均引入酶切位點XhoI和EcoR I,分別雙酶切后使用T4連接酶將目的片段cimA3.7和表達載體pHY-Pshuttle09連接形成重組質粒PA1。連接產物轉化E.coliJM109,挑測序正確的陽性轉化子,提取質粒并電轉于地衣芽孢桿菌細胞中,獲得重組地衣芽孢桿菌BLA。所用引物序列如表2所示。

表2 本研究所涉及引物序列Table 2 Primer sequences involved in this study

1.2.2 重組地衣芽孢桿菌全細胞轉化生產檸蘋酸

1.2.2.1 全細胞催化劑的制備

種子活化:將在-70 ℃甘油管保藏的重組地衣芽孢桿菌BLA劃線至帶有四環素抗性的固體LB平板,37 ℃培養12～16 h。從平板上挑取單菌落,接種于裝有15 mL LB培養基(含有終質量濃度為20 μg/mL的四環素)的錐形瓶中,置于37 ℃、250 r/min的搖床中培養24 h得到種子液。

搖瓶培養:種子液以10%的接種量轉接于裝液量為30 mL的不同發酵培養基中,37 ℃、250 r/min培養。每隔24 h取1 mL發酵液,記錄菌株的光密度OD600值;將發酵液于12 000 r/min條件下離心20 min,上清液用于HPLC分析檢測檸蘋酸及樣液中各組分含量。

菌體收集:將重組地衣芽孢桿菌置于篩選出的最優的發酵培養基中,37 ℃、250 r/min發酵培養48 h后進行9 000 r/min、4 ℃離心15 min棄去上清液,收集菌體。

1.2.2.2 全細胞轉化

使用預冷的TB溶液洗滌菌體2次,然后將菌體重懸于TB溶液中以形成細胞懸浮液,使得菌體濃度OD600值為60,加入終質量濃度為100 g/L的葡萄糖以及20 μg/mL的四環素。全細胞轉化反應體系25 mL在250 mL搖瓶中于37 ℃、250 r/min恒溫搖床上反應24 h。

1.2.3 產物的檢測與鑒定

將發酵液于12 000 r/min條件下離心20 min,取上清液加入等體積95%(體積分數)的乙醇溶液于4 ℃條件下沉淀蛋白8～12 h。離心后上清液經0.22 μm有機濾膜過濾。

HPLC檢測條件如下:流動相為硫酸-水(0.05%,體積分數);洗脫方式為等度洗脫;流速0.8 mL/min;示差檢測器;液相色譜柱為Dikma CarboPac H+(300 mm×8.0 mm,6 μm);柱溫50 ℃;進樣量10 μL。

1.2.4 全細胞轉化條件的優化

以發酵48 h后的菌體作為全細胞催化劑,后加入終質量濃度為100 g/L的葡萄糖,于37 ℃、250 r/min反應24 h的基礎上,分別考察菌體濃度(40～80)、搖床轉速(150～270 r/min)、轉化溫度(30～50 ℃)、葡萄糖質量濃度(50～200 g/L)以及初始pH(4.5～8.5)和轉化時間(24～132 h)對全細胞轉化合成檸蘋酸的影響。

2 結果與分析

2.1 檸蘋酸合酶基因的克隆與表達

如圖2-a所示,構建質粒pA1。首先以pEG重組質粒(本實驗室)為模板,通過反向PCR擴增獲得表達載體pHY-Pshuttle09;以pUC57-A重組質粒為模板進行PCR擴增,獲得cimA3.7目的基因片段。

M-5000 Marker;1-重組質粒pA1a-質粒pA1圖譜;b-重組質粒酶切鑒定圖2 質粒pA1圖譜及酶切鑒定電泳結果Fig.2 Construction map of plasmid pA1 and result for agarose gel electrophoresis of recombination vector

將表達載體pHY-Pshuttle09以及目的片段cimA3.7分別使用XhoI和EcoR I雙酶切,按照1.2.1的方法構建了重組質粒pA1。將重組質粒用XhoI和EcoR I雙酶切,酶切后理論條帶大小是275 bp和5 152 bp,結果如圖2-b所示,電泳條帶大小與理論值一致,表明重組質粒構建成功。

2.2 重組地衣芽孢桿菌全細胞催化劑的制備

2.2.1 發酵培養基的選擇

全細胞轉化實質上就是利用菌體內的酶作為催化劑,將底物轉化成產物的過程,所以通過發酵培養以獲取具有高密度、高催化活性的細胞是制備全細胞催化劑的關鍵因素。適宜的發酵培養基對微生物的生長代謝、酶的表達以及產物產出均會產生較大影響。分別選擇CMA、CMB、CMC 3種不同發酵培養基對重組地衣芽孢桿菌進行發酵,探究其對菌體生長及檸蘋酸產出的影響,實驗結果如圖3所示,經過168 h的發酵,使用CMB培養基與CMC培養基產生的檸蘋酸要明顯多于CMA培養基,且當發酵培養基為CMC時,菌體生長狀況最好,最終菌體濃度OD600值達到29.13,檸蘋酸產量可達1.94 g/L,說明檸蘋酸合酶在該條件下能更好地表達。根據陸一鳴等[25]研究,分析其原因是培養基中碳源及氮源對重組菌產生的影響:CMA、CMB培養基均以葡萄糖為碳源,葡萄糖的快速利用使得發酵后期缺乏足夠碳源維持菌體生長;而CMC培養基以蔗糖作為唯一碳源,其作為二糖在發酵后期可以繼續為重組菌的生長提供碳源,更有利于菌體生長。除此之外,CMC發酵培養基使用棉籽蛋白作為氮源,蛋白質含量高且含有維生素、游離氨基酸等營養成分,十分適合芽孢桿菌中酶的表達。因此,最終選擇CMC培養基作為發酵培養基來制備全細胞催化劑。

圖3 發酵培養基的選擇Fig.3 Selection of fermentation medium

2.2.2 產物的檢測與鑒定

將發酵后的樣品根據1.2.3所示的方法檢測產物的出峰,液相結果如圖4所示,在9.50 min葡萄糖被洗脫下來,在10.29 min產物被洗脫下來,且產物與葡萄糖、檸蘋酸標準樣品的出峰時間一致(圖4-a),由此判斷該產物為檸蘋酸,進一步驗證了重組地衣芽孢桿菌具有合成檸蘋酸的潛力。

a-葡萄糖、(R)-檸蘋酸混合標準樣品液相色譜圖;b-樣品液相色譜圖圖4 標準樣品(葡萄糖、R-檸蘋酸)和樣品的液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of standard (glucose、R-citramalate) and sample

2.2.3 重組地衣芽孢桿菌的發酵

選擇CMC發酵培養基進行重組地衣芽孢桿菌的發酵,結果如圖5所示,對于重組菌BLA,0～6 h為其生長對數期,菌體濃度迅速增加,24 h后開始逐漸進入穩定期,隨著發酵時間不斷延長,菌體量OD600值均呈現持續增長的趨勢。結合發酵過程中檸蘋酸生成的曲線可得,發酵36～48 h正處于菌體生長的穩定期,且該階段檸蘋酸生成的速率最快,可能是因為此階段菌體生物活性特征最好,綜合考慮檸蘋酸產量以及時間成本的問題,初步選擇發酵48 h后的菌體作為全細胞催化劑。

圖5 重組地衣芽孢桿菌BLA發酵過程分析Fig.5 Analysis of the fermentation process of recombinant Bacillus licheniformis BLA

2.3 重組地衣芽孢桿菌全細胞轉化產檸蘋酸條件優化

2.3.1 菌體濃度對檸蘋酸產量的影響

全細胞轉化過程實質上是胞內酶的催化過程,不同的菌體濃度(OD600值)代表不同的添加酶量。在初始條件的基礎上,考察OD600值對全細胞轉化合成檸蘋酸的影響,結果如圖6-a所示,當OD600值為70時,檸蘋酸的產量及轉化率最高,可能是因為當菌體濃度過低時,產生的酶量難以滿足細胞轉化所需,造成檸蘋酸產量低;當菌體濃度過高時,溶氧等因素受到了一定的限制,不利于產物的合成。所以OD600值為70是最適合檸蘋酸合成的條件。

a-菌體濃度;b-搖床轉速;c-溫度;d-葡萄糖質量濃度;e-pH;f-轉化時間圖6 不同條件對檸蘋酸產量及轉化率的影響Fig.6 Effects of different conditions on yield and conversion rate of citramalate

2.3.2 搖床轉速對檸蘋酸產量的影響

為探究溶氧對全細胞轉化合成檸蘋酸的影響,通過控制搖床轉速來調節不同溶氧的供應。轉速較慢時,發酵液中的溶氧量少,無法滿足細胞轉化所需;當轉速過快的時候,可能會使菌體損傷大,影響酶的表達和檸蘋酸的合成[26]。結果如圖6-b所示,隨著轉速的升高,檸蘋酸的產量及轉化率逐漸升高,到250 r/min時檸蘋酸產量達到最大,為3.35 g/L,轉化率為76.60 mg/g葡萄糖,之后過高的轉速不僅造成菌體損傷嚴重,而且主要副產物2,3-丁二醇的量也急劇增多,導致檸蘋酸的產量及轉化率下降。

2.3.3 轉化溫度對檸蘋酸產量的影響

轉化溫度關系著酶活性的高低,同時溫度成本的控制也是實現產物工業化的重要因素。通過選擇不同的溫度進行全細胞轉化產檸蘋酸的驗證,如圖6-c所示,隨著轉化溫度的升高,檸蘋酸的產量隨之升高,在37 ℃達到最高為4.78 g/L,轉化率為74.13 mg/g葡萄糖,之后產量逐漸降低。可能是因為在37 ℃時,檸蘋酸合酶的活性以及穩定性相對較高,因此選擇37 ℃為最適轉化溫度。

2.3.4 葡萄糖濃度對檸蘋酸產量的影響

檸蘋酸產生的直接前體物質是丙酮酸和乙酰-CoA,但考慮到成本問題,選擇更加經濟適用的間接前體物質葡萄糖作為全細胞轉化生產檸蘋酸的底物。本實驗考察了50、100、150、200 g/L葡萄糖對檸蘋酸產量的影響。如圖6-d所示,當葡萄糖濃度過高或過低時,均不利于檸蘋酸的產生,可能的原因是較少底物的添加不足以形成更多的產物,而過高濃度的葡萄糖可能會對菌體本身的代謝產生一定的抑制作用,不利于檸蘋酸的合成。當葡萄糖質量濃度為100 g/L時,檸蘋酸的產量最高,為4.55 g/L,轉化率為78.85 mg/g葡萄糖,此濃度的葡萄糖在足夠維持菌體代謝循環的基礎上又不造成原料的浪費。因此本研究最終選擇100 g/L的葡萄糖作為最佳反應條件。

2.3.5 初始pH對檸蘋酸產量的影響

控制轉化時的pH環境關系著胞內酶的活性及穩定性的高低,不同的pH會改變細胞的代謝通路以及細胞膜的通透性,從而影響菌體生長和產物合成[26]。因此針對全細胞轉化初始時的pH進行優化以確定最適pH。結果如圖6-e所示,最佳初始pH值為7.0,此時檸蘋酸產量為4.62 g/L,轉化率達到79.81 mg/g葡萄糖。可能因為此pH條件最適合檸蘋酸合酶的表達。

2.3.6 轉化時間對檸蘋酸產量的影響

轉化時間對檸蘋酸合成的影響十分顯著,隨著轉化時間的延長,菌體所處的環境及其本身的狀態均會發生變化,因此,本實驗考察了轉化時間為24、48、72、96、120、132 h對檸蘋酸產量的影響。如圖6-f所示,轉化120 h后檸蘋酸產量達到8.57 g/L,轉化率為142.84 mg/g葡萄糖,繼續延長發酵時間,檸蘋酸產量不再增加,考慮到時間成本的問題,確定最優的轉化時間為120 h。

3 結論與討論

本研究首次以地衣芽孢桿菌作為底盤細胞構建了檸蘋酸生產途徑,通過優化培養條件,實現了檸蘋酸合酶在重組地衣芽孢桿菌胞內的高效表達,并將重組菌用作全細胞生物催化劑合成檸蘋酸,利用優化后的全細胞轉化條件,采用CMC培養基制備全細胞催化劑,在37 ℃、pH 7.0、底物質量濃度為100 g/L、菌體濃度OD600值為70、搖床轉速為250 r/min 進行全細胞轉化120 h后,生成檸蘋酸8.57 g/L,轉化率為142.84 mg/g葡萄糖,這是目前報道的搖瓶水平細胞轉化合成檸蘋酸的最高產量,且沒有額外添加中和劑來維持細胞生長,進一步證明了地衣芽孢桿菌憑借其高耐受性更有利于產物的合成,為生物法生產檸蘋酸的研究奠定了基礎。

由于檸蘋酸前體物質的特殊性,在接下來的研究中,以檸蘋酸的產量為指標,通過代謝調控其前體物質丙酮酸和乙酰-CoA,確定影響檸蘋酸合成的限速步驟,進一步平衡二者的供應、細胞生長和產物合成,從而構建高產檸蘋酸的菌株,同時也為其他與該途徑相關物質的形成提供研究依據。