飲用水管網中抗生素抗性細菌/基因的賦存與控制

許 翔

(福建省環境保護設計院有限公司,福建福州 350002)

1929年,青霉素的發現標志著抗生素時代的正式開啟[1]。此后,抗生素作為減少傳染風險的有效手段,被廣泛用于人類與動物的治療[2]。但抗生素的長期濫用會導致微生物在環境壓力作用下逐漸產生耐藥性,從而造成抗生素抗性細菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)以及抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)大量繁殖[2-3]。環境中ARB/ARGs的存在會降低細菌對于抗生素的敏感性,導致超級細菌出現。如20世紀60年代耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)的出現、2010年印度超級細菌NDM-1(new delhi metallo-β-lactamase)的流行以及2011年德國“毒黃瓜”事件的暴發,引發了世界范圍內對超級細菌的恐慌[4-5]。實際上,由于抗生素抗性的產生,每年大約有70萬人喪生,且隨著耐藥性的持續增加,預計2050年,抗生素抗藥性將導致1 000萬人死亡,造成約100萬億美元的經濟損失[6-7]。當前,抗生素抗藥性在環境中的蔓延已成為全球性的公共安全問題,世界衛生組織已將其列入21世紀威脅人類健康的最重大挑戰之一。

區別于傳統污染物,ARGs具有明顯的生物學特征,其在環境中的傳播依賴于細菌增殖,如親代與子代之間的垂直基因轉移或相同/不同菌株、種屬間整合子、轉座子,以及質粒等可移動遺傳元件的接合、轉導與轉化,即水平基因轉移以及基因突變等[8]。這導致環境中的ARB/ARGs難以直接控制,從而被認定為新污染物[9]。大量研究[5,10-13]顯示,水源水、地下水、污水處理廠、飲用水廠以及龍頭水中均含有不同程度的ARB/ARGs。

水是人類的生命之源,而飲用水管網系統(drinking water distribution system,DWDS)作為飲用水輸送過程中的最后一環,若不對ARB/ARGs加以控制,其最終會通過飲用水進入人體腸道,增強腸道中的細菌耐藥性水平,從而對人體健康構成威脅[14]。因此,為更好地去除DWDS內的ARB/ARGs,本文將在介紹DWDS中ARB/ARGs來源與賦存的基礎上,重點闡述影響其賦存的重要因素,深入解析了與ARB/ARGs控制有關的切實可行技術,并對今后的研究內容與方向進行展望。

1 DWDS中ARB/ARGs的來源與賦存

已有研究[15]表明,ARB/ARGs的賦存往往與抗生素的檢出濃度存在明顯相關性。為此,研究人員[16]對我國南方某水源地所在水庫中含有的典型抗生素進行調查,結果檢出8種抗生素殘留,其質量濃度為1.20～130.00 ng/L。Yan等[10]進一步對長江流域5類20種抗生素進行時空分布測定,結果顯示,除磺胺嘧啶外,其他抗生素均有檢出,且以甲砜霉素和磺胺吡啶抗生素占比最大,最高質量濃度達到110 ng/L與219 ng/L。可見,水源水中抗生素的存在為ARB/ARGs的出現提供了條件。研究人員[17]進一步對美國某社區飲用水廠水源水中ARB/ARGs進行檢測,發現有攜帶四環素ARGstetA與磺胺類ARGssul1的多重抗藥性細菌。同樣地,在檢測杭州某飲用水源中E.coli分離株對于抗生素敏感性試驗時發現,大多數分離株都具有四環素耐藥性,其次是氨芐西林、哌拉西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑和氯霉素[14]。目前,水源水中普遍存在著ARB/ARGs。

水源水污染直接導致了飲用水廠中ARB/ARGs頻頻檢出。Pruden等[8]采用定量PCR(quantitative PCR, q-PCR)技術對美國某城市飲用水處理廠中ARGs進行檢測,結果顯示,水廠進水與出水過程中均有四環素類ARGstetO和tetW檢出。Guo等[18]對長江三角洲附近的7個飲用水處理廠進水中磺酰胺ARGssulI、sulII和四環素類ARGstetC、tetG、tetX、tetA、tetB、tetO、tetM、tetW進行檢測,發現其豐度大于105copies/mL,且出水中仍有不同水平的ARGs檢出。作為新污染物,目前尚未對ARB/ARGs去除有針對性的舉措,這直接導致了出廠水中ARB/ARGs的存在。

當飲用水進入分配系統后,通常需要花費數小時甚至數天才能在管道內到達家庭龍頭處,這期間復雜的物理與化學變化將進一步導致水質變化。研究[19]表明,大部分DWDS水中ARGs含量要高于水廠出水和飲用水源地中的ARGs含量。張練等[20]對DWDS中抗生素濃度的分布情況進行調查發現,其濃度呈現出先減弱后增加的趨勢,DWDS末梢中抗生素濃度集中,檢測到了四環素類抗生素、氯霉素類、大環內酯類抗生素以及林可霉素。Ateba等[21]對南非某DWDS中異養菌進行分離培養測定,也發現大多數菌株具有多重抗藥性,其中檢測到包括strA、strB21、dfrB13、aadA11、blaCTX-M5以及tetA3等在內的多種ARGs。目前,已通過高通量q-PCR測序技術對實際DWDS中ARGs進行檢測,發現超過100種ARGs,其總含量為105～1010copies/L[22]。進一步研究發現,與出廠水相比,自來水中ARGs的富集倍數為6.4～109.2,尤其是β-內酰胺酶ARGs,由平均值1.08×107copies/L上升至5.12×108copies/L[23]。綜上,DWDS是ARGs增殖的重要貯存庫(表1),需要引起人們的重點關注。

2 影響DWDS內ARB/ARGs賦存的因素

微生物安全是飲用水安全的基本要求,為此有關部門出臺了國標《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2022)、上海地標《生活飲用水水質標準》(DB 31/T 1091—2018)、深圳地標《生活飲用水水質標準》(DB 4403/T 60—2020)等一系列標準以保證水質安全,但細菌的抗生素抗性是近年來出現的新問題,且無論是ARB還是ARGs,均種類繁多,因此,這些標準均未涉及到飲用水ARB和ARGs的限值。DWDS中ARB和ARGs的普遍存在是不爭的事實,且DWDS內的獨特生存環境一定條件下會影響ARB/ARGs賦存和傳播能力。

2.1 水質特征

通常,當有環境壓力(抗生素、重金屬)存在時,ARB往往比敏感型細菌更有生長優勢,但細菌通過改變細胞膜通過性、抗生素滅活、外排泵,以及改變靶位點等方式獲得抗性的同時,不僅影響正常的生理代謝,而且會額外消耗物質與能量,導致其在沒有選擇壓力時與敏感菌競爭處于劣勢。而這一現象被稱為細菌的適應度代價[24-25]。一直以來,水體中抗生素濃度往往處于痕量水平(ng/L),但管網內卻出現了高水平的ARB/ARGs。研究[26]表明,飲用水所具有的典型環境特征在此過程中起到了重要作用,其中典型條件之一就是總有機碳(total organic carbon,TOC)濃度,其可以改變細菌對抗生素的表型耐受性。在貧營養條件下(TOC<0.05 mg/L),與野生型細菌相比,ARB的適應性代價將降低,即耐藥細菌變得更具競爭力[24]。Paulander等[27]的研究也有力地證實這一觀點,其發現較低的TOC濃度不利于RNA聚合酶σ因子(σS)的誘導,這將更有利于抗性菌的生長。在此基礎上,Wan等[28]通過中試試驗探究了不同TOC濃度下飲用水砂濾系統中ARB/ARGs的賦存與維持,結果顯示TOC濃度與ARB/ARGs豐度呈顯著負相關,且低TOC水平更有利于ARG高多樣性以及高豐度的維持。以上結果均表明,DWDS內低濃度TOC是影響ARB/ARGs賦存的重要原因。

2.2 消毒工藝

為了保證飲用水的微生物學安全性,自來水在出廠前都要經過消毒工藝處理。目前最常用的消毒劑是氯和氯胺。為了保證管網中細菌生長得到有效抑制,我國的飲用水標準中對DWDS末梢水的消毒劑余量也做了規定,例如余氯質量濃度不應低于0.05 mg/L。但實際上,DWDS中殘留的消毒劑并不能完全抑制細菌的生長。且由于消毒工藝所用種類、劑量以及接觸的時間不同,對ARB/ARGs賦存的影響也不盡相同。據報道,當水體中游離氯濃度較低時,可以觀察到多重耐藥菌P.aeruginosa的生長,但當其質量濃度升高達到0.3 mg/L后,經過長期暴露包括ARB在內的所有細菌都將失活[29]。研究人員[30]對比了不同消毒劑對DWDS中ARB的影響,發現氯胺消毒在去除含有磺酰胺抗性的細菌時表現優異,游離氯則對四環素和β-內酰胺酶類ARB的去除更有優勢。當紫外線(UV)光照強度達到200～12 477 mJ/cm2,ARGs的數量可下降2.48～4個數量級,UV會促進DNA中環丁烷嘧啶二聚體的形成,從而導致ARB失活[31]。

目前,氯消毒由于效果優良、操作簡便、價格低廉,在DWDS內得到了最為廣泛的運用[32]。研究[33]顯示,高劑量條件下,游離氯將破壞ARB細胞壁,并進入細胞質與DNA反應而使ARGs失活。但實際上,氯在DWDS中會不可避免地發生衰減,導致DWDS內余氯含量通常不能有效控制ARB/ARGs的賦存與生長。且研究人員[5,34]對氯化過程中ARGs豐度的改變原因進行探究,發現DWDS內余氯驅動微生物群落結構改變,這使得DWDS內細菌具有更高的抗生素抗性。進一步研究[5]發現,DWDS中耐氯菌Pseudomonas和Acidovorax會攜帶持久性ARGs,如多重ARGs(RND轉運系統)和桿菌肽ARGs(bacA),這是造成ARGs增加的主要原因。此外,氯消毒可以提高致病菌中ARGs的相對豐度,且單個ARG對氯脅迫敏感,同時氯化可以通過增加細胞通透性促進ARG轉移[31]。

消毒劑(如氯、氯胺)往往還可與水中有機物及其前體物反應產生消毒副產物(disinfection by-products, DBPs)[35]。近些年,研究人員[36]發現致突變DBPs會誘導細菌產生抗性,其原理是這些DBPs會使細菌產生基因突變,當突變為抗性突變時,細菌即獲得了可遺傳的抗性。如呂露等[37]選取3種典型DBPs對病原微生物P.aeruginosa與E.coli進行誘導,繼而觀察它們對于5種抗生素的響應,結果顯示菌株單一抗性提高1.48～12.01倍,多重抗性提高1.55倍。Li等[38]也觀察到同樣的情況,DBPs的存在使得E.coli對環丙沙星的抗性提高數倍。Lü等[36]進一步對機理進行闡述,外排泵的過量表達是P.aeruginosa對單個和多種抗生素的耐藥性增加的主要原因。同時對ARGs進行測序和分析,證實了該效應的機制是突變。此外,同樣的誘導現象也出現在E.coli中,這表明DBPs 對抗性的影響具有普適性。

2.3 細菌生長方式

DWDS中的細菌既可以游離形式存在,也可以管壁生物膜形式生長。有關研究[39]顯示,氯化處理過程中磺胺嘧啶、環丙沙星和磺胺嘧啶/環丙沙星的促進,能夠使附著于細菌尤其是ARB中胞外聚合物含量增加,胞外聚合物具有較高蛋白質含量和二級結構β-折疊,會導致更多的細菌聚集和吸附,從而有利于DWDS生物膜的形成。實際上,DWDS生物膜廣泛地分布于飲用水系統中,而抗生素抗性作為由抗生素或其他化學物質(如消毒劑)觸發而產生的適應性反應,相比游離細菌,其在生物膜中具有更高的抗性水平[40]。生物膜作為DWDS中抗生素抗藥性的儲存庫,主要通過以下幾種方式增強其抗性[15,41-42]:(1)生物膜的形成有利于微生物的附著生長,對強吸附性ARB而言提供了良好的生長環境,增強其在DWDS內的持久性;(2)為抗生素提供屏障,減少外界環境的干擾;(3)促進微生物之間遺傳物質的交換。有報道[42]稱,生物膜中S.aureus的結合轉移頻率比游離狀態高10 000倍。同樣,研究人員[30]對實際DWDS中的具有四環素、磺胺甲惡唑、克林霉素、諾氟沙星抗性的ARB進行為期一年的測定,其中ARB的分布情況如下:生物膜>出水>進水。

當生物膜的生長和積累到一定程度時,會影響管壁狀況,造成管道堵塞、金屬管道腐蝕加劇以及水質色度與嗅度的改變[22]。此時若水力條件發生變化,生物膜可能會從管道表面脫落,包括ARB在內的細菌會從生物膜轉移到主體水中,從而導致水質惡化[43]。由此可見,生物膜中ARB/ARGs的賦存被認為是威脅飲用水安全的重要因素。

3 DWDS中ARB/ARGs的控制

近年來,人們對于安全飲水意識的提升使其對水質也提出了更高的要求。而一旦ARB/ARGs通過飲水進入人體,將會影響有關抗生素的治療效果,更甚者會產生無藥可用的情況。因此,對管網內ARB/ARGs的管控勢在必行,且可以下3個方面進行。

3.1 增加深度處理

增加深度處理工藝,減少出廠水中ARB/ARGs的含量,對控制ARB/ARGs在DWDS內的分布至關重要。高級氧化技術被認為是提高飲用水中ARB/ARGs去除的有效手段[44]。Zhang等[45]發現UV/Cl處理在1 min內完全滅活Pseudomonas.HLS-6,而單獨UV照射在1 min內僅可降低4log,5 min內才能夠完全滅活。且經UV/Cl處理60 min后,sul1和intI1分別減少了至少3.50log ARGs和4.00log ARGs。此外,有研究人員[46]嘗試用UV-A/TiO2技術去除醫療廢水中的典型抗性菌,結果顯示TiO2劑量的增加會降低細菌的存活,催化過程將細菌數量減少了3log,但對部分抗性菌如MRSA的去除并不明顯。李樹銘等[47]對比了O3、UV和UV/O3消毒對4種ARB(Enterococcus、Brevibacillus、Pseudomonas、E.coli)以及4 種ARGs(tetA、blaTEM、sulI和strB)的去除,結果顯示ARB均得到了很好的削減,UV/O3會破壞細胞結構且不會導致光復活問題。而Fenton技術去除污水廠二級出水中ARGs過程中也可達到一定的效果,當pH值為3、Fe2+/H2O2摩爾比為1∶10的條件下,反應2 h,ARGs 可降低2.58log～3.78log[48]。除此之外,Breazeal等[49]發現有膠體存在時微濾與超濾能夠對ARGs進行截留。但Pruden等[50]認為攜帶ARGs的可移動遺傳因子能夠透過超濾膜的孔隙,而不能對其進行有效的控制。可見,目前膜過濾技術對于ARB/ARGs的去除具有不穩定性。

3.2 調控細菌生長

研究[51]表明,約有95%的細菌附著于生物膜生長。但相比去除成熟生物膜中的ARB/ARGs,控制管網內生物膜的生長是更為有效的措施。實際上,影響生物膜生長的因素很多,包括水中營養物質濃度、管道材質、流速和群體感應等[43,52]。

DWDS中的微生物大多是以有機物為營養基質的異養型細菌,控制水質中TOC,尤其是可同化有機碳(assimilable organic carbon,AOC)的含量,可減少生物膜在DWDS內的生長[53]。Kooij等[54]提出當DWDS中沒有消毒劑殘留時,AOC質量濃度低于10 μg/L可以使限制異養菌的生長。而Lechevallier等[55]則認為當存在大于0.5 mg/L的游離氯或1.0 mg/L的氯胺時,AOC質量濃度應低于50 μg/L或100 μg/L才可抑制細菌的再生。此外,DWDS的材料也會影響生物膜的生長速率。李爽等[56]在鍍鋅鋼管跟PVC管中模擬DWDS中生物膜的生長過程,6個月后,就生物量而言鍍鋅鋼管比PVC管中高出一個數量級,這是由于粗糙的表面加快了DWDS內的腐蝕使得微生物易于附著,在分泌的胞外聚合物作用下,會黏附更多的細菌以及營養物質,逐漸形成生物膜。12個月后,兩種管材內的生物量趨于穩定,此后管道材質對于生物膜的影響減少。因此,定期更新DWDS中的管段可以有效阻止生物膜的發育。流速也是影響DWDS中生物膜生長的重要因素,更高的流速會促進使DWDS內微生物分泌更多的胞外聚合物,從而有利于更加密實的生物膜形成[43]。這也從另一方面證實沖洗并不是去除DWDS內生物膜的有效途徑。群體感應是細菌間的一種交流機制,細菌向外界釋放信號分子,當濃度達到特定闕值時,會誘導細菌中特異性基因的表達反過來調節細菌間的行為方式[57]。Wu等[52]通過投加不同濃度酰基高絲氨酸環內酯類物質(acy-l homoserine lactone,AHL),發現在一定范圍內AHL可通過增加飲用水中相關菌株的生物量進而促進生物膜的形成。目前,實驗室條件下已成功通過投加天然的群體感應抑制劑,阻礙了活性炭表面生物膜的生長。

3.3 優化消毒方式

傳統消毒工藝對DWDS內ARB/ARGs去除有一定的局限性。研究[58]顯示,低氯劑量時(40 mg/L),細菌轉移接合效率增大了2～5倍。為此,優化消毒方式勢在必行。正如前文所述,DBPs與ARB的產生聯系緊密,減少DBPs的產生有利于降低ARB的含量。為此,陳超[59]開發了一種短時游離氯(<15 min)后轉氯胺順序氯化消毒工藝,經實驗室模擬以及中試調試,顯示相比傳統消毒,此消毒工藝能夠減少35.8%～77.0%的三鹵甲烷以及36.6%～54.8%的鹵乙酸產生量。此外,紀瑤瑤等[60]探究了順序氯化工藝對原水進行處理的最優反應條件,結果表明在加氨轉化時間為30 min時,經消毒處理24 h后,3種N-DBPs的前體物產量減少72%～82%。

4 總結與展望

目前,DWDS內ARB/ARGs富集現象已引起人們的廣泛關注。與常規工藝相比,先進的處理工藝對ARB/ARGs去除雖起到了一定的控制作用,但價格成本昂貴。我國作為抗生素使用大國,在建立醫療、畜牧等相關行業的管控策略從根本上減少源頭輸入的同時,未來應從以下幾個方面進行相關研究:

(1)闡明DWDS內細菌尤其是病原微生物中ARGs的富集與傳播機制;

(2)尋求低成本減少ARB/ARGs的方法,開發新型技術在降低成本的同時能夠針對性地去除DWDS內的ARGs;

(3)科學評估飲用水中與ARB/ARGs暴露相關的人體健康風險,可以此為依據建立對ARB/ARGs管控標準。