細菌整合子-基因盒系統表達調控的研究進展

汪小桐 戴碗琴

上海交通大學醫學院附屬松江醫院（籌）檢驗科，上海 201600

細菌耐藥問題已成為世界性難題，新型移動性基因元件-整合子的發現為人類研究細菌耐藥帶來了新的方向和挑戰。整合子可通過位點特異性重組捕獲耐藥基因，使耐藥基因在細菌中水平播散［1］。因整合子在細菌耐藥機制中的重要作用，引起研究者的廣泛關注。

細菌耐藥現狀

抗菌藥物的不合理使用導致耐藥菌層出不窮，“超級細菌”的出現更是給臨床治療帶來巨大挑戰。新型抗菌化合物及增效劑的研發是應對細菌耐藥的主要手段，然而細菌突變和自由轉換速度遠遠超過新藥研發速度，細菌耐藥形勢嚴峻。2014 年英國政府委托相關人員進行研究顯示，全球每年約70 萬人的死亡是與細菌耐藥性有關，如對現狀不加以控制，預計2050 年因細菌耐藥造成的經濟損失將達100 萬億美元，死亡人數約1 000 萬人［2］。美國疾病預防控制中心研究報告稱，2019 年到2020 年新型冠狀病毒大流行高峰之后，美國抗菌藥物耐藥性總體上升15%［3］。為遏制細菌耐藥性的發生和發展，研究者們對引起細菌耐藥的機制及播散原因進行了大量及深入研究［4-6］。20 世紀70 年代，人們大致確定了細菌耐藥與可傳播質粒有關，直到1989年Stokes和Hall［7］首次發現整合子，并通過研究認識到整合子幾乎存在于所有環境中，是細菌獲得抗生素抗性基因的主要機制［8］。

整合子的結構與功能

整合子是研究者在對耐藥質粒和轉座子進行相關研究時發現的一種移動性基因元件，其主要通過質粒和轉座子進行轉移［9］。整合子主要由5′保守區、3′保守區及中間的可變區組成。5′保守區主要包括編碼整合酶的基因intI及其啟動子Pint、重組位點attI和可變區的啟動子Pc［10］，3′保守區因整合子種類的不同而有所差異，可變區由數量不等的基因盒組成。

整合子主要根據整合酶氨基酸序列的不同進行分類，目前，常見的整合子可分為4 類：第1 類整合子因其獨特的進化優勢，導致其在臨床菌株中分布最廣，與細菌耐藥性關系最為密切［11］；第2 類整合子整合酶基因intI2 與intI1 有40%的同源性，但大部分第2類整合酶在編碼第178個氨基酸后插入一個終止密碼子TAA，不能翻譯成完整的整合酶蛋白，為無功能性第2 類整合子，不具有整合與剪切耐藥性基因盒的能力［12］；第3 類整合子目前在臨床上較為少見，首次由Arakawa 等［13］于1995年在耐碳青霉烯類抗菌藥物的黏質沙雷菌中的質粒上發現，2003 年在肺炎克雷伯菌中也分離出了第3 類整合子［14］；第4 類整合子可攜帶上百個基因盒，稱為超級整合子。目前，有研究認為超級整合子是耐藥整合子上基因盒的主要來源［15］。

整合子可通過位點特異性重組捕獲與表達耐藥性基因盒，使耐藥基因水平轉移，在細菌耐藥性產生和播散中起到至關重要的作用。

基因盒的結構與表達

基因盒是一種大小為500～1 000 bp 的游離環狀的可移動性基因元件，主要編碼耐藥基因，含有重組位點attC，該位點為整合酶識別位點。大部分基因盒不含有啟動子，其主要利用整合酶基因上的Pc 啟動子進行轉錄表達。整合子中基因盒通過不同的機制在轉錄和翻譯水平上進行調節，是一個嚴格而復雜的過程。

1.Pc啟動子在基因盒轉錄中的作用

基因盒一般以5′至3′的方向整合入整合子的attI位點，在上游整合子可變區啟動子Pc 的作用下得以表達，少數整合子啟動子Pc下游還存在啟動子P2［16］。

目前，在第1類整合子中發現13種Pc啟動子、4種P2啟動子以及多種Pc+P2 啟動子組合［17-18］。在臨床和自然環境中最常見的Pc 啟動子是強Pc 啟動子（PcS）、弱Pc 啟動子（PcW）、雜合Pc1 啟動子（PcH1）和雜合Pc2 啟動子（PcH2）。它們的分類基于相對轉錄強度，如PcH1 和PcS 在-35 區域的核苷酸序列分別為TGGACA 和TTGACA，二者僅有一個核苷酸不同，但轉錄強度差異有統計學意義，PcS 強度約為PcH1 的6 倍［18-19］。具有不同活性的Pc 啟動子序列的多樣性表明，細菌中耐藥基因盒的表達因整合子中Pc 啟動子的不同存在明顯差異。

第2 類整合子attI2區域內存在4 個潛在的Pc2 啟動子，分別為Pc2A、Pc2B、Pc2C 和Pc2D，分析Pc2 啟動子-35 和-10 區域的核苷酸序列發現，Pc2A 與PcS 相似。第5 個Pc2 啟動子Pc2E 發現于intI2 編碼序列中［12，20］。通過對數百個第2 類整合子序列分析顯示，Pc2A 和Pc2B 啟動子具有多態性，Pc2變體介導基因盒轉錄時，效率低于典型的Pc2A和Pc2B。這一發現表明，Pc2 變體活性較弱，導致基因盒表達減少，這種現象可能與適應性成本降低有關［20-22］。

第3類整合子基因盒的表達由啟動子Pc3介導，該啟動子位于intI3基因內部，與第1 類整合子中啟動子Pc 位置相同，啟動子Pc3也存在變體。通過實驗測定第3類整合子中鏈霉素addA2的抗性進而反映啟動子Pc3強度，結果表明其強度與第1類整合子中啟動子PcW+P2的強度相當［23］。

由于抗菌藥物的大量使用，細菌面臨更強的選擇壓力。Pc 啟動子序列通過隨機突變不斷出現新變體，使基因盒能夠有效表達，進而使細菌更好地適應新的變化。

2.基因盒位置效應對轉錄的影響

整合子中基因盒的位置對轉錄水平存在顯著影響，基因盒越靠近Pc 啟動子，其轉錄水平越高。早期研究者認為基因盒的轉錄同樣受上游基因盒attC位點的調控。attC位點的特征是不完全反向重復序列，具有顯著保守的回文組織［24］，轉錄過程中當其處于單鏈形式時，產生的發卡結構可能在基因盒轉錄過程中起到轉錄終止子的作用，導致下游基因盒轉錄水平下降。后期通過實驗發現，不同的發夾結構并未影響轉錄本的總數量，認為基因盒的轉錄并不受上游attC位點的影響［25］。

3.基因盒啟動子在基因盒轉錄中的作用

少數基因盒含有較長的5′未翻譯區域，這些區域可以為基因盒提供特定的啟動子，使基因盒即使遠離啟動子Pc，也能確保其有效表達［26］。第1 個被發現含有自身啟動子的基因盒為氯霉素耐藥基因cmlA1，實驗證實該啟動子PcmlA能有效介導cmlA1基因盒的轉錄并賦予載體氯霉素抗性［27］。

整合酶與整合子基因盒表達的相互作用

在第1 類整合子中，由于Pc 啟動子位于intI1編碼序列中［26］，其點突變導致intI1基因的非同義突變，從而引起整合酶氨基酸序列發生變化，影響第1 類整合子整合酶的重組活性。如前所述，第1 類整合子具有13 種Pc 啟動子，Pc 啟動子變體導致10 種IntI1編碼序列，其中3 種變體引起氨基酸序列改變，突變發生在第32 和39 位，分別為IntI1R32_H 39、IntI1R32_N39和IntI1P32_H39［17］。Jové等［17］研究整合酶變體活性時發現，第32 位殘基上由脯氨酸（P）替代精氨酸（R）、第39 位殘基由天冬酰胺（N）替代組氨酸（H）時，整合酶剪切效率顯著降低。通過對霍亂弧菌整合酶IntIA 的研究表明，這些氨基酸位于整合酶參與attC位點結合的α-螺旋結構內［28］，第32 和39 位點的氨基酸變化可能會干擾IntI1 與attC位點的結合，導致整合酶變體對基因盒的剪切效率降低。IntI1 變體對基因盒整合效率影響較小，表明對基因盒整合和剪切反應所涉及的整合酶區域可能不同。整合酶活性與基因盒表達呈負相關，即整合子需要基因盒高表達以適應外界環境時，可通過降低整合酶活性來維持整合子結構的相對穩定。這種調節機制代表了一種適應性反應，旨在降低適應性成本，有助于整合子的穩定。例如IntI1R32_H39 變體具有最有效的剪切活性，其啟動子為弱啟動子PcW+PcH1構型。

第2 類整合酶基因啟動子PintI2位于intI2起始密碼子正向40 bp 處，其基因盒功能性啟動子Pc2A 和Pc2B 嵌入attI2中，Pc2 和PintI2尾對尾排列，不會發生轉錄干擾。大部分第2 類整合子并不能翻譯成功能性整合酶蛋白，僅少數第2 類整合子具有剪切和整合基因盒的功能，這些功能性第2 類整合子的基因盒啟動子類型常為弱啟動子Pc2A 和Pc2B 變體，基因盒轉錄效率較低，說明弱的Pc 啟動子決定了更有效的整合酶，這種負相關與第1 類整合子類似。第2 類整合子因此被分為兩類，一類為攜帶Pc2A 和Pc2B 啟動子，能有效表達有限的基因盒，但整合酶無活性，不能促進基因盒創新；另一類為少見的功能性第2 類整合酶，它可以捕獲新的基因盒，但基因盒轉錄效率低。

關于第3類整合子功能的研究較少，實驗證明第3類整合酶在attI3位點具有較低的識別和重組活性［23］。第3類整合子的啟動子PintI3位在attI3內，基因盒啟動子Pc3 位于intI3基因內，第3 類整合酶基因的表達可對基因盒的轉錄進行干擾［29］，從Pc3開始的轉錄也會影響第3類整合酶的表達，進而影響第3類整合酶的重組活性，兩者相互影響。

結 語

整合子-基因盒系統的發現是人類在細菌耐藥研究過程中的里程碑。大量研究顯示，整合子及基因盒的表達是一個復雜且精密的過程［7，18，20］。外界環境的不斷變化，使細菌處在一個選擇壓力下，為了快速適應壓力，整合子-基因盒系統通過精細調節，為宿主細菌降低適應性負擔，提供選擇優勢，在創造細菌多樣性方面發揮重要作用。通過對整合子-基因盒系統的深入研究，發現其為細菌耐藥防控帶來困難的同時也為相關研究提供了新思路。