日本三角渦蟲hsp60 基因的分子克隆和功能研究

陸瓊 ， 李睿， 宋鴿鴿， 馬克學

（1. 漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南 漯河 462002； 2. 河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉 453007；3. 河南省營養與健康工程研究中心，河南 漯河 462002）

干細胞是動物組織和器官再生的重要細胞來源，但干細胞穩態受到一些外在的（如電離輻射、重金屬和藥物等）和內在的（如活性氧等）有害因素的影響（Cie?lar-Pobudaet al.，2017；Salvettiet al.，2020）。因此，干細胞維持在細胞世代中的穩定性和持續的自我更新能力必然受到一系列蛋白質的保護（Fan，2012）。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類在細胞應激狀態下表達的蛋白質，研究發現該類蛋白質在各類干細胞中高表達，對維持干細胞內的穩態具有重要的保護作用（Shendeet al.，2019）。淡水渦蟲作為研究再生的經典模式動物，逐漸受到國內學者的廣泛關注（王志紅等，2019；馬克學等，2021；張芬熙等，2021）。渦蟲強大的再生能力基于其體內被稱為“Neoblasts”的多能干細胞（宇文延青等，2016；Reddien，2018），它可以分化形成神經細胞、肌肉細胞、腸道細胞和表皮細胞等。HSP60是熱休克蛋白家族中的重要成員，研究發現其對魚鰭再生及造血干細胞、胚胎干細胞的穩態維持很重要（Makinoet al.，2005；Seoet al.，2018；Choiet al.，2022）。但HSP60 在渦蟲再生中的研究還不深入。本文從日本三角渦蟲Dugesia japonica中克隆了HSP60 的cDNA 全長序列，初步研究了其在渦蟲再生中的表達模式，以及干擾HSP60 表達對渦蟲再生的影響。上述工作為深入研究HSP60 在渦蟲再生和抗逆性中的作用機制奠定了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

日本三角渦蟲為本實驗室無性繁殖獲得的單克隆品系，18 ℃避光培養，每2周喂食一次牛肝，實驗前至少饑餓1 周。再生用渦蟲沿咽前咽后切割成3段，置于20 ℃培養，分別于再生1 d、3 d、5 d、7 d 收集渦蟲提取RNA 和進行原位雜交實驗，以整體渦蟲為對照。

1.2 總RNA提取和Djhsp60 cDNA克隆

將渦蟲于液氮中研磨成粉末后加入Trizol 試劑，按照試劑盒操作說明提取總RNA，然后將總RNA 反轉錄成cDNA，并以此為模板進行PCR 擴增。根據本實驗室篩選的Djhsp60EST 序列設計3’-RACE 和5’-RACE 特異性引物（表1），按照RACE cDNA 試劑盒（Clontech）進行PCR 擴增。PCR 片段經純化后連接pMD19-T 載體，篩選陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司測序分析，根據測序結果拼接出Djhsp60全長cDNA序列。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 Djhsp60基因組結構分析

根據Djhsp60cDNA 全長序列，設計1對特異性引物（表1），以DNA為模板進行PCR擴增。PCR片段經純化后連接pMD19-T 載體，篩選陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司測序分析。通過比較Djhsp60基因DNA序列和cDNA 序列即可獲得基因組內含子信息。

1.4 生物信息學分析

序列同源性比對和相似性搜索在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行，多序列比對采用DNAMAN6.0，開放閱讀框預測和氨基酸序列分析采用DNAstar 5.0，蛋白質結構域分析采用Expert Protein Analysis System（http：//www.expasy.org），HSP60 親緣關系樹采用Clustal x 1.83 和Mega 3.1構建，以人Homo sapiens為外群，系統樹各分支的置信度由Bootstrap 1 000次循環檢驗。

1.5 qPCR分析

總RNA 提取和cDNA 合成同前。PCR 反應體系為20 μL：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（ROX plus）10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板1 μL，滅菌超純水7.4 μL。PCR反應在ABI 7500系統中進行：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個循環。以持家基因Djef2為內參，以2–ΔΔCT法計算mRNA 相對表達量，實驗重復3 次。采用SPASS 10.0進行單因子方差分析，P<0.05表示差異顯著。

1.6 整體原位雜交和雙熒光原位雜交實驗

整體原位雜交根據King 和Newmark（2013）的操作并稍作修改，主要實驗步驟如下：1、渦蟲用2%HCl 處死后立即用4%甲醛溶液固定30 min；2、樣品經50%甲醇溶液和100%甲醇洗滌后，?20 ℃凍存24 h；3、樣品經過含6%H2O2的甲醇溶液漂白過夜；4、樣品經PBST 洗滌后用蛋白酶K 處理，然后用4%甲醛溶液固定30 min；5、樣品經PBST 洗滌后加入預雜交液，然后加入雜交液，56 ℃雜交>16 h；6、樣品經過充分洗滌后加入anti-DIG-AP抗體，4 ℃孵育過夜，雜交信號用BCIP/NBT顯色，Leica DFC300FX 顯微鏡拍照后用Adobe Pho?toshop處理。

雙熒光原位雜交實驗樣品處理步驟同前，雜交液中含Dig-標記的Djhsp60探針和Fluorescein-標記的DjwiA探針。雜交完成樣品洗滌后先用anti-DIG-POD（1∶2 000 稀釋；Roche，Catalog No. 11207733910）抗體4 ℃孵育過夜，用Rhodamine-tyramide避光顯色。樣品再次洗滌后用anti-fluorescein-POD（1∶2 000 稀釋；Roche，Catalog No. 11426346910）抗體4 ℃孵育過夜，用FITC-tyramide 避光顯色。蔡司體式熒光顯微鏡（Axio Zoom. V16）拍照后用附帶的軟件處理。

1.7 RNAi實驗

雙鏈RNA（dsRNA）的合成按照Rouhana 等（2013）提供的方法進行。將合成的10 μg dsRNA與20 μL 牛肝勻漿混合后，喂食25 條左右長度為3～4 mm 渦蟲，間隔3 d 喂食一次，共喂食5 次。以GFP dsRNA 作對照。當渦蟲頭部開始退化時切割渦蟲觀察再生表型，用Leica DFC300FX 顯微鏡拍照，圖片用Adobe Photoshop 處理。收集再生5 d 的個體用于qPCR檢測和原位雜交實驗。

2 結果

2.1 日本三角渦蟲hsp60基因的分子特征

采用RACE 技術獲得日本三角渦蟲hsp60基因的全長cDNA 序列1 851 bp，5’-有50 bp 的非翻譯區，3’-有73 bp 的非翻譯區并含有polyA 尾，在polyA 尾上游14 bp 處可見AATAAA 的加尾信號（圖1）。將該序列命名為Djhsp60，并在GenBank 注冊（GenBank 登錄號：MH509193）。Djhsp60基因的開放閱讀框長度1 728 bp，編碼575個氨基酸，分子量61.7 kD，理論等電點5.79。DjHSP60 的蛋白質序列中N 端含有進入線粒體的導肽序列，C 端含有典型的GGM 重復序列，中間區域含有HSP60 蛋白家族高度保守的標簽序列（AAVEEGIVPGGG）和ATP 結合結構域。亞細胞定位分析顯示（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/），該蛋白定位于線粒體，屬于線粒體HSP60 蛋白家族。此外還測序了Djhs60的DNA 序列，發現該基因結構區僅有1 個內含子，位于第56 位賴氨酸密碼子AAA 和第57 位甘氨酸密碼子GGT 之間，內含子的5’-和3’-拼接位點符合典型的“GT-AG”法則（圖2）。

圖2 Djhsp60基因結構（方框示內含子）Fig. 2 Structure of Djhsp60 gene （intron between AAA codon and GGT codon was boxed）

圖3 基于鄰接法建立的扁形動物門HSP60家族親緣關系樹Fig. 3 Phylogenetic tree of HSP60 family members from Platyhelminthes based on the Neighbour-Joining

2.2 DjHSP60的親緣關系分析

NCBI Blast 檢索分析顯示，DjHSP60 氨基酸序列與已經報道的脊椎動物和無脊椎動物HSP60s的氨基酸序列高度同源，與人、小鼠Mus musculus和斑馬魚Danio rerio的同源性分別是71.4%、71.8%和71.7%，與果蠅Drosophila melanogaster和日本血吸蟲Schistosoma japonicum的同源性分別是73.4%和78.9%。地中海渦蟲Schmidtea mediterranea基因組數據庫（http：//smedgd.neuro.utah.edu）的檢索結果顯示，其同源性基因Smedhsp60編碼的也是575 個氨基酸的蛋白質，與DjHSP60 的一致性為95.1%。HSP60 親緣關系樹顯示，所有的吸蟲和絳蟲分別聚類形成2個獨立的姊妹分支，而自由生活的渦蟲則從寄生蟲中獨立出來形成一個單獨的分支，與人的親緣關系更近。

2.3 Djhsp60的表達模式分析

整體原位雜交顯示，Djhsp60陽性細胞在除咽以外的組織中均有表達（圖4：A），尤其是在實質組織中表達量較高，且陽性細胞成簇分布（圖4：A1）。雙熒光原位雜交顯示，Djhsp60與渦蟲干細胞marker基因DjwiA的表達模式非常相似，存在明顯的共表達現象（圖4：B）。原位雜交顯示，渦蟲再生1 d，Djhsp60的陽性表達信號在傷口下的組織中顯著增強（圖4：C）。隨再生進行，Djhsp60的陽性表達信號逐漸減弱（圖4：C）。qPCR 檢測結果顯示，與對照組相比，Djhsp60表達量在再生1 d后升高了約5.3 倍，然后隨再生進行表達量逐漸下降（圖4：D）。

圖4 Djhsp60的表達模式Fig. 4 Expression pattern of Djhsp60

2.4 干擾Djhsp60對渦蟲再生的影響

干擾20 d 后，渦蟲頭部逐漸退化直至消失（圖5：A1～A3）。進一步研究發現，干擾組渦蟲喪失了再生能力（圖5：B1～B4）。qPCR 檢測結果顯示，干擾后內源性Djhsp60表達量降低了約60%（圖5：C1）。原位雜交結果顯示，干擾后的蟲體Djhsp60轉錄本的表達信號顯著減少（圖5：C2、C3）。

圖5 干擾Djhsp60對渦蟲再生和組織穩態的影響Fig. 5 Effects of RNAi-Djhsp60 on planarian regeneration and homeostasis

2.5 干擾Djhsp60 對渦蟲干細胞相關基因表達的影響

原位雜交結果顯示，干擾組幾乎檢測不到渦蟲干細胞標志基因DjwiA的陽性表達（圖6：A）。

圖6 干擾Djhsp60對渦蟲干細胞相關基因表達的影響Fig. 6 Effects of RNAi-Djhsp60 on the expression of planarian stem cell-related genes

qPCR 結果顯示，干擾組渦蟲DjwiA的表達量是對照組的0.18 倍，表達量減少約80%；其他渦蟲干細胞marker 基因Djmcm2、Djpcna和Djh2b的表達量也顯著降低，分別是對照組的0.25 倍、0.33 倍和0.13倍（圖6：B）。

3 討論

HSP60是熱休克蛋白家族中的重要成員，主要分布在線粒體，對線粒體穩態的維持發揮重要作用（Duanet al.，2020）。Seo 等（2018）發現，HSP60在干細胞中表達較高，參與干細胞增殖的調控。淡水渦蟲是研究再生的經典模式動物，渦蟲再生依賴其體內的多能干細胞。已有研究發現，一些熱休克蛋白家族成員如HSP90、HSP70和HSP40在渦蟲干細胞表達且是渦蟲再生所必需的基因（Donget al.，2018；Wanget al.，2019；Wanget al.，2022）。但HSP60 在渦蟲中的研究較少。本文首先采用RACE 技術從日本三角渦蟲中克隆出hsp60基因的全長cDNA 序列，并推導出其編碼的氨基酸序列。經檢索分析，無論是核苷酸序列還是蛋白質序列，都與目前報道的HSP60 高度同源，且DjHSP60 含有HSP60 家族的標簽序列和C-端高度保守的GGM 重復序列。研究還發現，Djhsp60僅含有1 個內含子。內含子少便于轉錄本的快速加工剪切，以應對環境應急做出快速反應，這可能是渦蟲熱休克蛋白基因的共性特征（馬克學等，2013；Maet al.，2014）。HSP60 系統進化樹顯示，渦蟲比絳蟲和吸蟲更接近人類，這與最新提出的渦蟲的分類地位一致（陳廣文，馬克學，2008）。

渦蟲干細胞屬于未分化細胞，主要在實質組織中分布。而高度分化的組織如肌肉質的咽中的干細胞較少。本研究發現，Djhsp60轉錄本主要在皮下實質組織中表達，且成簇分布，與Orri 等（2005）報道的渦蟲干細胞分布模式非常相似。此外，Djhsp60與渦蟲干細胞marker 基因DjwiA共表達。且地中海渦蟲信息學數據庫（https：//plano?sphere.stowers.org/feature/Schmitea/mediterranea-sex ual/transcript/SMED30025522）檢索表明，HSP60 在Smedwi?1（地中海渦蟲干細胞標志基因，與DjwiA同源）陽性細胞中表達，進一步說明Djhsp60陽性細胞具有干細胞的特征。渦蟲切割后1 d，Djhsp60強陽性表達信號出現在傷口下組織中，說明此處干細胞增殖活躍，急需產生大量的新生細胞來再生出缺失的組織和器官。隨渦蟲再生進行，新再生組織（如前端頭部）細胞逐漸分化，Djhsp60陽性表達信號逐漸減弱。這種表達模式與Seo 等（2018）報道的基本一致，即HSP60 在干細胞中的表達量高而在分化細胞中表達量低，敲除HSP60 表達影響干細胞增殖。本研究還發現，干擾后的渦蟲耳突結構消失、頭部逐漸退化。干擾Djhsp60的表型與干擾地中海渦蟲干細胞標志基因Smedwi?1的表型非常相似（Reddienet al.，2005）。因為渦蟲耳突前的組織缺乏干細胞，干擾很可能影響了渦蟲干細胞的增殖，導致頭部組織不能有效地進行細胞更新，所以干擾后渦蟲頭部組織逐漸退化消失。此外，干擾后絕大多數蟲子喪失了再生能力，進一步說明干擾很可能影響了干細胞的功能。原位雜交和qPCR 技術研究干細胞相關基因的表達變化，結果發現，干擾后渦蟲干細胞相關基因的表達量極顯著降低。上述研究表明，Djhsp60屬于渦蟲干細胞相關基因，在渦蟲再生和組織穩態維持中發揮重要作用。

本文報道了日本三角渦蟲HSP60 的核苷酸序列和氨基酸序列，初步研究了其表達譜和干擾其表達對渦蟲再生的影響，為進一步深入研究其在渦蟲再生和環境應激反應中的作用奠定了良好基礎。