老年男性沃辛瘤Th淋巴細胞亞群及細胞因子檢測的實驗研究*

王鳳鳳，李傳真

沃辛瘤腫瘤上皮為假復層結構的嗜酸性上皮細胞，腫瘤間質為淋巴樣組織，其內常見淋巴濾泡形成，這與淋巴結相類似。從胚胎發育學來說，沃辛瘤是由于腮腺導管上皮細胞迷走于腮腺內的淋巴結發生瘤變而成[1]，沃辛瘤淋巴間質來源于胚胎時期的淋巴組織。本文主要對沃辛瘤淋巴間質中Th 淋巴細胞亞群及細胞因子分布特點研究。

1 材料與方法

本實驗研究方案遵循赫爾基宣言的倫理原則，獲得海南醫學院第二附屬醫院倫理委員會的審批（編號：LW2018076）。收集2018 年8 月至2020 年8 月于海南醫學院第二附屬醫院就診的32 例腮腺沃辛瘤男性患者，中位年齡61 歲，均在我科行手術切除，且病理診斷為沃辛瘤。

1.1 實驗方法

1.1.1 Th 淋巴細胞亞群鑒定 隨機選取收集的腮腺沃辛瘤標本中24 例，應用免疫組化檢測T-bet(Th1)、Gata3(Th2)、RORγt(Th17)、Foxp3(Treg) 表 達 情況。以上抗體均購自Abcam 公司，免疫組化試劑盒(二抗）購自博士德生工生物有限公司。10%的福爾馬林固定液固定，制作石蠟切片（4um），每一例標本制作4 張切片，常規脫蠟、梯度酒精脫水，陽性對照組分別為抗T-bet、Gata3、RORγt 及Foxp3+Treg 抗體，抗體滴度均為1：100，PBS 替代一抗加入切片Foxp3+Treg 抗體，作為陰性對照組，DAB 顯色，蘇木素復染。細胞核棕褐色著色為陽性表達，正置顯微鏡下觀察、計數。

1.1.2 應用GSH-INF-3-1 抗體芯片技術檢測8 例沃辛瘤標本相關細胞因子（由上海華盈生物公司完成），將各細胞因子表達量進行Zscores 轉換，采用R3.6.0 語言進行非聚類分析形成熱圖。

1.2 統計學方法

1.2.1 Th1、Th2、Th17、Treg 淋巴細胞亞群陽性細胞占比 將24 例標本中Th1、Th2、Th17 及Foxp3+Treg 陽性表達使用病理圖像采集和分析系統（OLYMPUS cellSens Dimension）進行檢測：高倍鏡下隨機選取5 個視野，使用軟件的“染色功能”，標記選中視野中所有陽性細胞。利用軟件中“擦除功能”，人工核對原圖片，排除“假陽性”的標記區域，對陽性細胞進行計算，得出結果，取5 個視野平均值，此基礎上再取24 例標本的±s(%)，得到實驗數據。然后用origin 軟件形成散點間距圖。

1.2.2 熱圖使用方法 將各因子表達量進行Zscores轉換，R 熱圖包（heatmap，ggplot2）選擇非聚類的方法進行展示。

1.2.3 R 語言分析細胞因子表達相關性 采用R 語言分析細胞因子之間表達相關性，分析結果以紅色表示正相關，藍色表示負相關，顏色強度越高表示相關性越強，并且以白色星號（*）表示顯著性，其中*表示顯著相關（P ＜0.05），**表示非常顯著相關（P＜0.01），***表示極顯著相關（P＜0.001）。

2 結 果

2.1 Th 淋巴細胞亞群分布情況 T-bet、Gata3、RORγt 陽性細胞分布于GC 外周，大部分Foxp3+Treg 陽性細胞分布在GC 外周，同時在GC內部成零星分布，如圖1 所示。Th1、Th2、Th17及Foxp3+Treg 陽性細胞占比（±s，%）為2.48±2.129、0.70±1.101、0.97±1.002 及6.26±3.567，Th1/Th2、Th17/Foxp3+Treg 陽性細胞占比之間比值分別為3.5/1、1/6.5。散點間距圖，如圖2 所示。

圖1 Th 淋巴亞群細胞免疫組化陽性表達（箭頭所示），圖片倍數為：×20

圖2 Th1、Th2、Th17 及Foxp3+Treg 陽性細胞占比散點間距圖

2.2 沃辛瘤細胞因子抗體芯片檢測結果

2.2.1 沃辛瘤細胞因子表達情況熱圖分析 用GSH-INF-3-1 抗體芯片技術檢測的40 個細胞因子（IL-1α、IL-1ra、IL-4、IL-17、MCSF、MIP-1a、BCL、Eotaxin、Eotaxin-2、G-CSF、GM-CSF、I-309、ICAM-1、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-6sR、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、MCP-1、MIG、MIP-1b、MIP-1d、PDGF-BB、RANTES、TIMP-1、TIMP-2、TNFa、TNFb、TNF-R Ⅰ、TNF-R Ⅱ），對檢測結果進行熱圖分析，結果表明沃辛瘤中ICAM-1、IL-8、IL-16、MIP-1b、PDGFBB、RANTES 及TIMP-2 表達程度相對較高（圖3）。

圖3 細胞因子表達量熱圖分析

2.2.2 應用R 語言分析沃辛瘤各細胞因子之間表達相關性 衰老相關分泌表型重要因子IL-1β、IL-6 及TNF 與多種炎性因子表達呈顯著正相關。IL-10、GM-CSF、IL-11、IL-7、IL-13、IL-12p70及IL-2 與TNF 表達密切相關，IL-6sR 與TNF-R

3 討 論

豐富的淋巴間質是沃辛瘤病理特征之一，Th1、Th2、Th17 淋巴細胞亞群主要分布在非淋巴濾泡的淋巴間質區域，Foxp3+Treg 分布于淋巴濾泡外周、淋巴濾泡邊緣及淋巴濾泡內，這與文獻報告結果相一致[2]，Foxp3+Treg 數量明顯高于Th1、Th2 及Th17。從胚胎發育學上來說，沃辛瘤淋巴間質來源于胚胎時期的淋巴組織，文獻資料顯示正常淋巴組織中Th1／Th2 比值為1/1，而Th17/Treg 比值為1/5[3]，而沃辛瘤中Th1 ／Th2 比值為3.5/1，Th17/Foxp3+Treg 比值為1/6.5。沃辛瘤Foxp3+Treg 數量相對增多可能與淋巴間質增齡性變化有關。研究表明，外周血及淋巴組織Fopx3+Treg 細胞在不同年齡段的人群及小鼠含量有一定差異，Foxp3+Treg 隨年齡增大而增加[4-7]。小鼠也存在Foxp3+Treg 增齡性變化，月齡大于20周的Balb/c 小鼠無論是外周血還是脾、淋巴結，CD4+CD25+Treg 比例明顯增加[8]。Foxp3+Treg 的主要功能之一是抑制炎癥反應，其數量增多可能與沃辛瘤炎癥反應程度較強烈有關。

TNF-α，IL-1β，IL-6是非常重要的促炎因子[9-11]，它們在沃辛瘤中均有表達，并且這些因子與許多炎表達密切相關；IL-8、TIMP-2 分布與IL-1β 表達相關；與IL-6 表達相關的主要包括PDGF-BB、IL-15、IL-1α、IL-5、IL-11、IL-7、TNF-β、IL-12p70 及IL-2（圖4）。CXCL13 及ICAM-1 為淋巴濾泡形成重要因子，與CXCL13 表達相關的主要包括TNF-R Ⅰ、TIMP-1、G-CSF、IL-16、MIP-1d、MIG 及I-309,與ICAM-1 表達相關主要有TNF-R Ⅱ及IL-6sR。性因子的表達呈密切相關，如IL-10、GM-CSF、IL-11、IL-7、IL-13、IL-12p70，形成復雜的細胞因子網絡。沃辛瘤淋巴間質呈典型慢性淋巴結表現，這些炎性因子組成有利于慢性炎癥發展的細胞因子網絡，這可能在維持沃辛瘤慢性炎癥表現中起重要作用。同時，TNF-α，IL-1β，IL-6也是衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype ,SASP）的重要細胞因子[12]。沃辛瘤好發于老年患者，其淋巴間質增齡性變化可能促進TNF-α，IL-1β，IL-6 等促炎因子廣泛表達，這些促炎因子促進淋巴間質發展及淋巴濾泡增生，這可能是沃辛瘤好發于老年吸煙患者的原因之一。

圖4 細胞因子之間相關性R 語言分析

CXCL13 及ICAM-1 是生發中心形成過程中起重要作用的細胞因子[13-14]。本研究中，沃辛瘤TNF 與CXCL13、ICAM-1 表達呈正相關，而研究表明TNF-α 可以促進血管內皮表達ICAM-1及巨噬細胞分泌CXCL13,TNF-β(lymphotoxin-β)可誘導成纖維網狀細胞分泌CXCL13[15-17],因此TNF-α-TNF-β 可能參與沃辛瘤淋巴濾泡形成。此外，IL-12p40 與CXCL13 表達密切相關，IL-12p40 可以單體形式存在，或者分別與p35、p19 亞基結合，形成有活性的IL-12（IL-12p70）及IL-23。本研究表明，IL-12p70 與CXCL13 表達無相關，提示IL-12p40 可能通過IL-23 促進沃辛瘤CXCL13 表達，但仍需進一步實驗證實。沃辛瘤淋巴間質增齡性變化有促于淋巴間質的發生發展，這可能是沃辛瘤好發于老年患者的病理生理基礎。