不同水平包膜丁酸鈉對刺參(Apostichopus japonicus)生長性能、消化酶活性、非特異性免疫和抗病力的影響

高永剛,趙 浩,徐玉珊

(1.榮成市海洋經濟發展中心,山東 威海 264300;2.中國海洋大學,山東 青島 266061;3.榮成市海洋與漁業監測減災中心 山東 威海 264300)

刺參(Apostichopusjaponicus),因其豐富的營養價值成為我國北方地區重要的水產養殖品種之一[1]。近二十年來,隨著人民生活水平不斷提高,刺參的市場需求也不斷擴大,刺參養殖業也得以快速發展起來[2-3]。但隨著集約化養殖方式的不斷擴大[4],刺參免疫力下降、病害頻發等問題日益嚴重。同時,傳統使用的抗生素被國內國際官方機構列入禁用清單[5],因此,探求更高效、更安全的新型飼料添加劑尤為重要。

丁酸具有維持機體腸道上皮細胞正常形態、調整菌群微生態平衡、促進損傷修復的特性。通過在飼料中加入適量丁酸,可以提高飼料酸度,進而降低機體腸道內的pH值大小,從而有效地促進胃腸道消化酶分泌[6-7],繼而起到促進生長、提高機體免疫力的作用。本文選取丁酸鈉作為添加物,但由于丁酸鈉具有特殊氣味和不穩定的化學特性,為便于飼料加工和刺參采食,試驗采用生物包被技術制備而成的包膜丁酸鈉(MSB),以減少流失等產生的試驗誤差。目前,在飼料中添加丁酸鈉的研究主要集中在畜禽養殖生產方面,如仔豬[8-10]、荷斯坦牛[11]、蛋雞[12]等,在水產動物的報道集中在魚類品種[13],在刺參飼料中添加丁酸鈉的相關研究鮮有報道。因此,本試驗旨在通過刺參飼料中添加不同水平包膜丁酸鈉,分別測定各組刺參的特定生長率、消化酶活性、腸道生長狀況和免疫酶活性等指標,以探究丁酸鈉在刺參飼料之中添加效果和適宜的添加水平,為包膜丁酸鈉在水產一線的推廣及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

本試驗在山東省威海市榮成市好當家集團有限公司南海育苗基地苗種研究所的養殖實驗車間開展。試驗設計五個處理組、一個對照組,每個處理組3個重復(整個試驗共計18個處理),每個處理組分別投喂相應水平梯度試驗飼料。

所有試驗用刺參首先要經過7 d暫養以適應環境溫度和飼料。暫養期間水質條件: 水溫(16.0±0.5) ℃, 溶氧>9.6 mg/L, 氨氮水平<0.05 mg/L。暫養飼料使用配置的基礎飼料。暫養結束以后,所有刺參禁食24 h。馴化結束后,選取大小相仿、健康活躍、狀態優良、質量均勻的刺參360頭,隨機分配于18個0.70 m×0.5 0 m×0.50 m養殖箱(養殖容積約為180 L)中。養殖周期為60 d,期間晝夜不斷,持續沖氧,水溫(16±0.5)℃,鹽度30‰左右,溶氧度>9.98 mg/L,pH值7.6～8.2;每天上午10點準時換水1/3,下午3點準時投喂一次,并控制投喂量為刺參體重的5%。

1.2 飼料配方和制備

從飼料生產車間選取適當的飼料原料,設計試驗基礎飼料配方如表1。

表1 試驗飼料配方以及營養成分(%,干物質基礎)

在基礎飼料上添加不同水平(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/kg)的包膜丁酸鈉(由青島百美佳生物科技有限公司提供, 有效包膜丁酸鈉成分為74.13%),同時設置0 g/kg為對照組。同時以微量纖維素作為飼料添加劑調節組分(微量纖維素不具有功能性飼料添加劑的功能)。

將飼料原料依據品目分別粉碎過100目篩,得到的微量成分采取逐級擴大的試驗配方的比例定量混合均勻,放入V型攪拌機中充分混合30 min。加水混勻, 經顆粒飼料機制成直徑為2.5 mm的硬顆粒, 將得到的顆粒飼料用烘干機在40 ℃條件下烘干至飼料水分含量10%左右,放在雙層封袋之中,放置于在-20 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品采集與處理

試驗結束后,將各組刺參禁食24 h,再進行各組分的采樣和分析。

1.3.1 生化樣品的采集 每個水箱隨機選取10頭刺參,用解剖剪將腹面剪開,取出呼吸樹、腸道,用生理鹽水沖洗以去除其中的食物殘渣, 用定性濾紙擦凈后置于1.5 mL離心管中。用無菌注射器采集體腔液后裝入1.5 mL離心管內,迅速將取得的樣品放入液氮速凍后, 于-80 ℃條件下保存,用于消化酶活性和非特異性免疫活性酶的測算。每個水族箱內刺參全部采集混合后作為一個重復樣本,緊接著進行體成分的采集。

1.3.2 體成分采集與測定 將取完生化樣品的刺參腹面完全剪開以去除剩余的體腔液, 在相同部位取一塊體壁(1 g 左右), 置于1.5 mL離心管中。剩余體壁冷凍保存以備常規成分及氨基酸分析等測定使用。試驗所用玻璃器皿和解剖工具均在180 ℃灼燒5 h以去除RNAase后進行操作。

1.3.3 生化樣品處理 分別選取每個樣品中的0.3～0.5 g體壁或腸道樣品,剪碎,加入4倍體積的冰冷生理鹽水(0.86%),制成20%勻漿,在4 ℃條件下10 000 g離心20 min,取出上清液分裝待測。體腔液樣品則先置于4 ℃冰箱中解凍后, 再用超聲波粉碎儀進行細胞破碎, 然后4 ℃條件下376 g離心10 min, 收集上清體腔液及底層體腔細胞分裝待測。

1.4 生長指標的測定與計算

試驗開始和結束,分別對養殖箱內的刺參逐個進行稱重并計數,再根據下列公式計算刺參相關生長指標。

增重率:WGR=(Wt-W0)/W0×100%;

存活率(SR,%):SR=Nt/No×100%;

特定生長率(SGR,%/d):SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%;

臟壁比:RV=Wv/Wb×100%;

飼料系數:FCR=M/(Wt+Ws-Wo);

式中:Wo和Wt分別為試驗開始和結束時刺參的重量;N0和Nt分別為試驗開始和試驗結束時每個養殖箱內刺參的數量;Ws則為養殖過程中死亡的刺參質量;t為試驗周期;Wv為內臟質量,g;Wi為腸道質量,g;Wb為體壁質量,g;M為養殖過程中的投飼量。

1.5 消化酶的測定

冷凍樣品在冰上解凍,并用0.9%的生理鹽水進行勻漿。將得到的勻漿液在4 ℃,10 000 g條件下,進行20 min離心操作。靜置后取得上層清液進行酶活性測定,所有勻漿液樣品4 ℃下保存并在24 h內測定。蛋白酶活力采用福林酚方法測定,淀粉酶及脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。嚴格參照操作說明,保證所有待處理樣品在24 h內測定完畢。

1.6 非特異性免疫酶活性的測定

把冷凍樣品在冰上解凍,在4 ℃,3 000 g條件下離心20 min。上清液轉移到1.5 mL離心管中,4 ℃條件下保存,選取超氧化物歧化物酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、溶酶菌(LSZ)活性、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性為本試驗非特異性免疫酶活性的指標,采用南京建成生物工程有限公司的試劑盒進行測定,嚴格參照操作說明,保證所有待處理樣品在24 h內測定完畢。

1.7 攻毒試驗

1.7.1 制備菌懸液 將致病菌燦爛弧菌(VibriosPzendidu)置于37 ℃下培養48 h,得到的細菌液用5 mL滅菌海水進行洗菌沖洗,制成細菌懸液,取l mL經過不同的梯度稀釋后用血球計數板計數,最后調整至l擴109CFU/mL。

1.7.2 攻毒試驗 在60 d養殖試驗結束后,對所有取樣后的剩余刺參個體,依次注射濃度為109CFU/mLV.Pzendidu菌液0.5 mL進行攻毒試驗,水溫控制在16 ℃。將刺參放回原試驗水箱,保持連續不斷通氧養殖,持續時間為15 d。攻毒期間其它養殖條件不變,不進行飼料投喂,每日觀察并記錄刺參的死亡情況,最后統計死亡率。

1.8 數據統計分析與記錄

通過 SPSS 22.0 軟件進行試驗數據統計分析。所有數據在滿足方差齊性和正太分布檢驗后,進行單因素方差分析和 Tukey’s 多重比較分析,顯著性水平為P<0.05。數據以平均值±標準誤差(Mean±S.E.M)來表示。

2 試驗結果

2.1 對刺參生長性能的影響

不同水平的包膜丁酸鈉(MSB)對刺參生長性能的影響見表2。隨著飼料中MSB添加量的增加,刺參的增重率和特定生長率出現先提高后降低的趨勢,在MSB添加水平為3.0 g/kg時達到最大,顯著高于對照組(P<0.05),但與2.0 g/kg組差異不顯著(P>0.05);MSB添加水平為1.0、4.0、5.0 g/kg時刺參增重率和特定生長率與對照組差異不顯著(P>0.05)。對于臟壁比,在飼料中添加MSB水平為2.0、3.0 g/kg時的刺參臟壁比顯著低于對照組(P<0.05),而當MSB添加水平為1.0、4.0、5.0 g/kg刺參的臟壁比與對照組差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同水平包膜丁酸鈉(MSb)對刺參生長性能的影響

如圖1所示,對于飼料系數,在飼料中添加MSB對刺參飼料系數的影響呈現先降低后增高的趨勢,添加水平為2.0 g/kg時刺參飼料系數達到最低,顯著低于試驗組(P<0.05),與添加水平為3.0 g/kg時不具有差異性(P>0.05)。

不同字母代表處理間差異顯著(P<0.05),下同。

2.2 對刺參腸道消化酶活性的影響

如圖2所示,MSB在飼料中添加不同水平而對刺參消化道中消化酶的活性影響不同。對于蛋白酶,飼料中添加不同水平MSB均不同程度地提高了刺參蛋白酶活性;添加水平2.0 g/kg時刺參的蛋白酶活性最高,顯著高于對照組(P<0.05);包膜丁酸鈉(MSB)添加水平為1.0、5.0 g/kg時與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。對于淀粉酶,MSB添加水平為2.0、3.0、5.0 g/kg的淀粉酶活性顯著高于對照組(P<0.05),而彼此之間不具有統計學上的差異(P>0.05)。對于脂肪酶,MSB添加水平為3.0 g/kg時,刺參的脂肪酶活性最高,顯著高于對照組(P<0.05);MSB添加水平為1.0 g/kg時脂肪酶活性與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 飼料中添加不同水平的包膜丁酸鈉(MSB)對刺參淀粉酶活性、脂肪酶活性和蛋白酶活性的影響

2.3 對刺參非特異性免疫酶活性的影響

在飼料中添加不同水平的MSB對刺參免疫酶活性的影響見圖3。隨著飼料中的MSB添加水平的提高,刺參SOD活性呈現出逐漸升高后又下降的趨勢,總體較對照組均有不同程度的提高,其中在添加水平為3.0 g/kg時達到最高,顯著高于對照組(P<0.05)。MSB添加水平為2.0 g/kg時過氧化氫酶活性為最高,顯著高于對照組(P<0.05)。隨著MSB的添加水平提高,刺參溶菌酶活性呈現期初略微下降,待添加水平超過2.0 g/kg后開始提高的趨勢,當添加水平提升到4.0 g/kg時,溶菌酶的活性抵達峰值并且顯著高于對照組(P<0.05)。飼料中添加不同水平MSB刺參的堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性呈現先提高后下降的趨勢。

圖3 飼料中添加不同水平包膜丁酸鈉對刺參超氧化物歧化酶、

2.4 對刺參抗病力的影響

潑灑燦爛弧菌(VibriosPzendidu)后,被感染的刺參攝食量下降,體色變淺發白,體壁發軟,體表腐皮增多直至最后死亡。圖4顯示為刺參的累計死亡率,除對照組和添加包膜丁酸鈉(MSB)水平為1.0 g/kg組從第一天開始出現化苗,其余處理組均從潑灑后的第二天開始死苗。在整個攻毒周期內,對照組的刺參死亡率始終高于試驗組,在第9天達到了穩定的69.0%;添加水平為4.0 g/kg時刺參累計死亡離從第5天起開始顯著低于其他的試驗組,在第8天達到穩定的35.67%,顯著低于對照組(P<0.05);添加水平為5.0 g/kg時,前期的死亡率得到有效控制,處于較低值,在第4天驟然上升,最后穩定在了57.33%,與對照組差異不顯著(P>0.05)。添加水平在2.0 g/kg時較其他試驗組相比,最早達到穩定的44.67%,與對照組差異顯著(P<0.05)。

*表示與對照組差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 對刺參生長性能的影響

丁酸鈉具有提高動物生長性能的作用,在畜禽、水生動物養殖生產過程中都有了一定的研究報道。在畜禽方面,徐振飛等[14]發現肉仔雞配合日糧中添加300 mg/kg包膜丁酸鈉能顯著提高肉仔雞生產性能;在水產動物上,楊良輝等[15]發現添加丁酸鈉是保障羅非魚良好生產性能的首選;張淞林等[16]發現飼料中添加1.0‰的丁酸鈉,美洲鰻鱺增重率提高了37%,飼料系數降低了26%;孫浪等[17]發現在飼料中丁酸鈉添加量為2.5 g/kg時,鯽魚增重率、特定生長率、蛋白質效率和肥滿度分別提高了25.76%、16.46%、28.91%和8.37%。本試驗結果與上述報道相類似,在飼料中添加一定劑量的包膜丁酸鈉可以促刺參生長,隨著丁酸鈉添加量的增加,不同處理組刺參的增重率、特定生長率有先增后減的趨勢,添加水平為3.0 g/kg丁酸鈉處理組刺參的增重率、特定生長率達到最大,顯著高于對照組(P<0.05),此時飼料系數為最低,此時的生長和營養利用效率最高。但當丁酸鈉高于3.0 g/kg時刺參的生長情況逐漸變差,這可能與其抑制了刺參的腸道發育水平和降低了刺參對營養物質的消化吸收率有關,不再具有誘導刺參生長的作用。

臟壁比是內臟質量與體壁質量的比值大小,它反映出刺參的體壁作為有效生長部分所占的比例,比例越小說明個體的體壁長勢越好。在本試驗中,當包膜丁酸鈉添加水平為2.0、3.0 g/kg時,臟壁比明顯低于對照組和其他處理組。這說明當包膜丁酸鈉添加水平介于此時,刺參的體壁處于較好的生長狀態,總體有更好的生長趨勢。由此可得知,適量的包膜丁酸鈉可保證刺參的快速生長。

3.2 對刺參腸道酶活性的影響

消化酶是水生動物生長的關鍵因素,刺參的消化系統對攝入的營養物質消化和吸收能力依賴于腸道中微生物的種類以及數量,建立良好的腸道酶環境,可以高效地提高生物的生產性能及其飼料利用。

關于丁酸鈉可以誘導腸道消化酶活性的作用機理近年來在畜禽、水產生產上有過相應的報道。在畜禽方面,相關研究表明在仔豬日糧中添加丁酸鈉能改善斷奶仔豬腸道黏膜形態結構,促進消化器官的生長發育[8],影響腸道酶活性[9]以及有效降低腹瀉率[10]等。在水產養殖方面,研究表明鯽飼料中丁酸鈉添加量達到2.5 g/kg時,鯽干物質與蛋白質表觀消化率、前腸絨毛高度、腸道CREB基因和CDX2基因的相對表達量分別提高8.36%、6.21%、34.22%、51.11%和42.13%[17]。在該試驗中,在飼料中添加不同水平的包膜丁酸鈉后結果顯示消化酶活性都發生了相應的變化。飼料中包膜丁酸鈉水平為2.0、3.0、5.0 g/kg時刺參淀粉酶顯著高于對照組(P<0.05)。添加水平2.0 g/kg時刺參的蛋白酶活性最高,顯著高于對照組(P<0.05)。飼料中包膜丁酸鈉水平為2.0、3.0、4.0 g/kg時刺參脂肪酶活性顯著高于對照組(P<0.05)。此試驗結果說明在飼料中添加一定劑量范圍內包膜丁酸鈉可顯著提高刺參的腸道消化酶活性,從而提高刺參對營養物質的吸收利用效率。

3.3 對刺參非特異性免疫力的影響

刺參屬于低等的棘皮動物,自身不具備復雜多樣的高級免疫系統,更多的是依靠著非特異性免疫來增強對疾病的抵抗力,維持機體正常的生理狀態,其中:超氧化物歧化酶(SOD)是水產動物體內的一種重要的抗氧化物酶,它可以有效去除動物體內產生的多余的超氧化物自由基,保護細胞免受損傷。CAT能分解過氧化氫,減輕機體過氧化程度。丁酸鈉通過調節機體免疫和抗氧化功能來增強機體清除自由基的能力,減少組織和細胞損傷,研究發現在飼料中添加0.1%的丁酸鈉提高了美洲鰻鱺抗氧化能力和過氧化氫酶(CAT)25%和15%[5]。在飼料中添加400 mg/kg微囊丁酸鈉顯著提高了團頭魴的肝胰臟中 T-SOD 活性[10]。在草魚中添加適量丁酸鈉上調了過氧化氫酶(CAT)活性[8],提高了抗氧化損傷能力。本試驗結果與上述研究結果相似。在飼料中添加包膜丁酸鈉水平為2.0、3.0 g/kg時刺參SOD、CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)。除添加水平為1.0 g/kg時,各處理組的刺參SOD活性較對照組都有不同程度的提高,這說明在飼料添加包膜丁酸鈉能夠提高刺參抗氧化能力,提高刺參免疫力。

溶菌酶(LSZ)是水生動物中先天性免疫調節中的一個重要的免疫反應指標。在團頭魴(羅玲,2018)飼料中添加適量丁酸鈉顯著提高了溶菌酶(LSZ)活力。本試驗中,除添加包膜丁酸鈉水平為1.0 g/kg處理組外,其它各組刺參LSZ活性均顯著高于對照組(P<0.05),總體呈現先增高后下降的趨勢,與張曉曉等[18]研究結果相類似。

酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)在動物解毒系統中起到重要的作用,而且與一些營養物質的消化吸收有重要關系。酸性磷酸酶是生物體中巨噬細胞的標志酶[19],它是體內巨噬細胞活性程度的指標[20],AKP是重要的解毒系統。本試驗中,添加水平為3.0 g/kg和2.0 g/kg時刺參的堿性磷酸酶(AKP)與酸性磷酸酶(ACP)活性分別達到最大值,顯著高于對照組(P<0.05),總體而言,在飼料中添加不同水平的包膜丁酸鈉提高了刺參的堿性磷酸酶(AKP)與酸性磷酸酶(ACP)活性。

3.4 對刺參抗病力的影響

攻毒試驗是反映機體免疫力最直觀的方式。相關研究報道顯示,將刺參置于濃度106cells/mL的燦爛弧菌海水中能夠使刺參患腐皮綜合癥而致死[20]。本試驗中采用注射方式對刺參進行攻毒,通過測定攻毒后各處理組中的刺參累計死亡率來評價添加不同水平包膜丁酸鈉對刺參抗病力的影響。試驗結果表明,通過比較各組刺參最終存活數、累計死亡數得出包膜丁酸鈉可提高刺參對于燦爛弧菌的免疫抗病能力,并且在開始階段包膜丁酸鈉對刺參的抗病力隨添加水平的增加而提高,但當添加水平達到2.0%時,刺參死亡率反而上升,這同潘麗俊等[21]研究包膜丁酸鈉對球蟲感染兔的結果相類似,此時高水平的丁酸鈉失去了提高刺參的抗病能力的作用。這表明在飼料中添加適量的包膜丁酸鈉在一定程度上可以改善動物機體的抗菌、抗病、免疫能力。但應當注意到,丁酸鈉對于刺參抗病力的影響效果也會因不同的試驗對象、不同的外界環境條件和不同的試驗流程設計等變化而不同。

3.5 包膜技術的使用效果

水產動物特殊的生存環境導致目前丁酸鈉此類添加劑在水產養殖中的應用受到限制,研究發現在飼料添加劑中廣泛應用包膜技術可以有效減輕丁酸鈉在水體中的溶淋作用[22],使得丁酸鈉在消化道中獲得了緩釋,更好地發揮效用。在本試驗條件下,隨著丁酸鈉添加水平的提高,刺參的增重率和特定生長率呈現先提高后降低的趨勢。

4 結論

在刺參飼料中添加適量的包膜丁酸鈉可以提高刺參的生長性能、腸道消化酶活性和非特異性免疫酶活性,以生長性能為參考,飼料中包膜丁酸鈉的適宜添加量為2.0～3.0 g/kg。在考慮經濟成本的情況下,刺參日糧中添加2.0 g/kg包膜丁酸鈉為最佳劑量。