擬穴青蟹STEAP4-like基因的克隆與表達分析

房亞夢,范欣悅,孔彤彤

(曲阜師范大學 生命科學學院, 山東 曲阜 273165)

擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)為梭子蟹科、青蟹屬,是一種重要的經濟養殖蟹類,廣泛分布于中國和印度-西太平洋沿岸。然而隨著海水養殖業的快速發展,與集約化水產養殖方式的出現,青蟹感染病原微生物的機率也大大增加[1]。呼腸孤病毒(Reovirus)、雙順反子病毒(Bicistronic virus)、白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)等病毒感染引起的病毒性疾病是引起青蟹病害的重要原因,嚴重制約了青蟹養殖業的健康發展[2-3]。其中,WSSV是海洋動物常見的致病性病毒,可以感染絕大多數的海洋甲殼動物,給水產養殖業帶來了嚴重的經濟損失。已有報道指出野生和養殖的擬穴青蟹均可通過注射、喂養及病蟹(或蝦)傳染等多種途徑感染WSSV[4-5]。但到目前為止,還沒有明確防治WSSV感染的有效辦法。

前列腺6跨膜上皮抗原4(six-transmembrane protein of prostate 4,STEAP4),屬于STEAP家族,首先從小鼠的3T3-L1細胞中分離得到,可被腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α, TNF-α)誘導表達,因此也被稱為腫瘤壞死因子α誘導蛋白(TNF-α induced adipose-related protein,TIARP)[6]。又因其與STAMP1基因的序列有高度相似性而被稱為STAMP2[7]。STEAP4由六個跨膜α-螺旋以及細胞內親水性的N末端和C末端組成[8]。N端包含一個與原核生物F420 相似的結構域,即NADP+氧化還原酶結構域;C端的跨膜結構域與釀酒酵母鐵還原酶同源[9]。已有研究證明,STEAP4是一種金屬還原酶,可以將細胞外Fe3+還原為Fe2+,Cu2+還原為Cu+,將電子從胞內的NADPH轉移到細胞外的鐵或銅,進而參與調控鐵和銅的穩態,在細胞炎癥應激的反應中發揮重要作用[10-11]。STEAP4參與調控代謝過程,并與代謝性疾病相關[12-13]。STEAP4在前列腺癌中上調表達,具有致癌作用,與結腸癌、肝癌和乳腺癌等癌癥的發生相關[14-19]。除此之外,研究發現STEAP4抗體可抑制人脂肪細胞前體的增殖,促進其凋亡,說明STEAP4可能參與細胞增殖及凋亡途徑[20]。

目前關于STEAP4的研究主要集中在哺乳動物,然而無脊椎動物STEAP4的研究極少。本研究克隆了STEAP4-like基因cDNA序列,對其進行生物信息學分析,利用qRT-PCR技術檢測其組織分布情況,及其在WSSV感染后的表達應激情況,構建原核重組表達載體,并誘導表達與純化重組蛋白GST-STEAP4-like,為解析STEAP4在無脊椎動物中的功能及探究擬穴青蟹抗WSSV免疫反應機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物:健康的擬穴青蟹購買自廣東省汕頭市牛田洋養殖場,將其暫養于鹽度為 10‰的海水中,一周后用于后續實驗。

主要試劑: Trizol購自 Invitrogen公司;DNA Marker、PrimeSTAR2Max DNA Polymerase購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、超薄DNA產物純化試劑盒、EasyGeno單片段重組克隆試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)、FastKing 一步法反轉錄熒光定量試劑盒(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司;pEASY?-Blunt Cloning Kit 購自北京全式金生物技術有限公司;ACD抗凝劑:NaCl 450 mM/L,葡萄糖100 mM/L, 檸檬酸25 mM/L,檸檬酸鈉30 mM/L,加水至1 000 mL,調 pH值至 4.7。

實驗引物見表1:

表1 實驗所需引物

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成 首先抽取青蟹血淋巴于含有等體積ACD抗凝劑的RNase-free EP管中,4 ℃,600×g,離心10 min,收集血細胞。然后用Trizol試劑提取血細胞總RNA,并分別用瓊脂糖凝膠電泳與Nanodrop 2000檢測RNA的完整性及濃度。接著用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA 。

1.2.2STEAP4基因的克隆與鑒定 根據轉錄組數據庫的已知序列,設計并合成STEAP4-like基因引物(S-F和S-R),進行PCR反應。PCR反應體系(25 μL):2×PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,cDNA模板1 μL,上下游引物各1 μL。反應程序:98 ℃ 10 s,54 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,35個循環。瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR產物,并切下目的條帶,然后利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的DNA片段與pEASY?-Blunt載體25 ℃條件下,連接30 min后,轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,使用引物M13-F和M13-R進行菌液PCR鑒定,將陽性克隆子并送至廣州艾基生物技術有限公司測序。

1.2.3STEAP4-like基因的生物信息學分析 通過ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.Cgi)在線預測分析STEAP4-like基因的開放閱讀框及氨基酸序列;利用National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和SMART software (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測分析STEAP4或STEAP4-like蛋白的保守結構域;用ExPasy工具(https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白大小;用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對STEAP4-like氨基酸序列進行多序列比對,再用Jalview軟件作圖;使用MEGA5.2軟件構建系統進化樹。

1.2.4STEAP4-like基因組織特異性表達分析 分別取4只健康青蟹的血淋巴、鰓、肌肉、胃和內皮組織,血淋巴樣品利用Trizol法提取血細胞RNA;其余組織于液氮速凍后,用fast 200組織總RNA極速抽提試劑盒提取其總RNA。用Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測提取的總RNA的質量和濃度后,參照FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒(去基因組) 實驗操作說明合成 cDNA。根據FastKing 一步法反轉錄熒光定量試劑盒(SYBR Green)說明書,配置反應體系:模板 2 μL,上游引物和下游引物各 0.8 μL,ddH2O 6.4 μL,2×FastReal qPCR PreMix 10 μL。qRT-PCR反應條件為:95 ℃預變性 30 s,40 個循環的 PCR 擴增( 95 ℃ 變性 5 s,60 ℃退火 30 s)。內參基因為β-actin。每個樣品生物學重復3次,根據2-ΔΔCt算法,計算目的基因的相對表達量。

1.2.5STEAP4-like基因WSSV感染前后表達分析 將健康青蟹在實驗室馴養一周后,給每只青蟹注射200 μL濃度為1×106copies/mL的WSSV混懸液。分別在注射0、12、24、48、72 h和96 h后抽取青蟹血淋巴,并離心收集血細胞沉淀用于提取RNA。再用qRT-PCR方法檢測STEAP4-like基因在不同時間點的表達量。采用單因素方差分析(ANOVA)和t-test分析顯著性差異,P<0.05為顯著性差異,P<0.01為極顯著性差異。

1.2.6STEAP4-like原核表達載體構建 用特異性引物r-F和r-R擴增STEAP4-likeORF全長(不含終止密碼子),并回收目的片段(具體參照方法1.2.1);參照 TIANGEN 的質粒小提試劑盒說明書,提取pGEX-6p-1質粒,并用 EcoRⅠ和XhoI雙酶切,37 ℃,3 h。參照 TIANGEN 超薄 DNA 產物純化試劑盒說明書,回收酶切產物,用Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測濃度后,利用EasyGeno單片段重組克隆試劑盒將其與目的DNA進行連接,50 ℃,20 min。將連接產物轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中,用引物 pGEX5'和pGEX3'進行菌液PCR鑒定,將篩選陽性克隆子并送至廣州艾基生物技術有限公司測序。

1.2.7 重組蛋白GST-STEAP4-like的誘導表達及純化 將篩選得到的陽性單克隆子過夜活化后,按照1∶100的比例分別轉接至三瓶含有氨芐青霉素的LB新鮮培養液中,37 ℃,180 r/min搖培3～4 h,待菌液OD 600 nm值為0.5左右時,取其中一瓶菌液 l mL作為未誘導對照組;另外兩瓶加入 IPTG至其終濃度為 0.1 mM,分別置于16 ℃和37 ℃,140 rpm誘導培養 14 h和3 h。分別取5 mL菌液用于檢測蛋白表達情況,4 ℃,6 000 r/min離心5 min收集細菌細胞沉淀。用含 0.1% Triton X-100的PBS重懸細菌沉淀,冰上間歇(破碎3 s,停5 s)超聲破碎至菌液清亮后,4 ℃,13 000×g 離心 10 min,收集上清和沉淀。分別加入DTT、5× SDS-PAGE loading buffer(沉淀還需要加PBS)混勻后,95 ℃加熱5 min,10 000 rpm離心后用于SDS-PAGE電泳。收集16 ℃,IPTG誘導培養的細菌細胞破碎上清液,參考全式金 ProteinIso GST Resin說明書純化重組蛋白;并SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化情況。

2 結果與分析

2.1 STEAP4-like基因的克隆與二級結構預測分析

克隆得到擬穴青蟹STEAP4-like基因cDNA序列(GenBank號OQ658507),長1 495 bp,開放閱讀框(ORF)長1 443 bp,編碼480個氨基酸(圖1)。預測擬穴青蟹STEAP4-like蛋白(Sp-STEAP4-like)大小為52.6 kDa,Sp-STEAP4-like蛋白 N端含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)結合位點(圖2)。Sp-STEAP4-like和美洲螯龍蝦STEAP4-like蛋白(Ha-STEAP4-like)N端都含有一個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)氧化還原酶輔酶結構域,C端均含有一個鐵還原酶跨膜結構域,而Pv-STEAP4-like僅N端有一個NADP氧化還原酶輔酶結構域(圖3)。

注:方框為NADP氧化還原酶輔酶結構域;直線為鐵還原酶跨膜結構域;圓圈區域為NAD結合位點;*為終止密碼子

注:方框為NAD結合位點

注:美洲螯龍蝦STEAP4-like(Ha-STEAP4-like: XP_042212141.1);南美白對蝦STEAP4-like(Pv-STEAP4-like: XP_027210822.1); Homarus americanus STEAP4-like (Ha-STEAP4-like: XP_042212141.1); Penaeus vannamei STEAP4-like(Pv-STEAP4-like: XP_027210822.1)

2.2 STEAP4-like同源性及系統進化樹分析

將STEAP4-like蛋白的氨基酸序列與NCBI數據庫中其他物種的氨基酸序列進行同源性比對,發現其與三疣梭子蟹(Portunutusstritubercula)相似性最高,為86.46%,其余相似性在40%～60%之間(圖4)。系統進化樹結果表明,擬穴青蟹STEAP4-like與三疣梭子蟹和突眼蟹(Chionoecetesopilio)聚為一支,親緣關系最為接近(圖5)。具體物種信息見表2。

注:方框為NAD結合位點

注:用 Neighbor-Joining trees 方法構建擬穴青蟹STEAP4-like氨基酸序列系統進化樹,結果用 1000 bootstraps檢測其重復性;擬穴青蟹STEAP4-like用五角星標出

表2 氨基酸多序列比對與系統進化樹中其余物種信息

2.3 STEAP4-like基因的組織分布

利用qRT-PCR 技術檢測STEAP4-like基因在擬穴青蟹各組織中的表達情況,并以STEAP4-like基因在血淋巴中的表達量為參照。檢測結果表明,STEAP4-like基因在所檢測的各組織中均有表達,其中在肌肉中表達量最高,其次在胃、鰓中的表達量較高,在內皮中的表達量最低(圖6)。

圖6 STEAP4-like組織分布

2.4 WSSV感染擬穴青蟹后STEAP4-like的表達

本實驗通過qRT-PCR 技術檢測STEAP4-like在注射WSSV后不同時間點的表達情況。結果表明在 WSSV 刺激后 0、12、24、48、72 h和96 h, 青蟹血細胞中的STEAP4-like基因顯著性下調表達(圖7)。

圖7 WSSV感染后STEAP4-like的表達

2.5 STEAP4-like重組蛋白的原核表達及純化

SDS-PAGE檢測結果顯示,在70 kDa左右處有較濃條帶,大小符合預期。表明經IPTG誘導后,重組蛋白GST-STEAP4-like可在上清液中表達,即可溶性表達,且在16 ℃,過夜誘導條件下表達量較高(圖8 A)。收集16 ℃誘導的細菌細胞,經超聲破碎后離心,取上清液,并用GST-resin純化GST-STEAP4-like蛋白。結果如圖8 B所示,純化后在70 kDa左右處有GST-STEAP4-like蛋白條帶,且條帶較為單一,濃度較高,表明蛋白純化成功。

注:圖A GST-STEAP4-like誘導表達。M:預染蛋白 marker; 1:未誘導的上清蛋白;2:16 ℃誘導后的上清蛋白;3:37 ℃誘導后菌液的上清蛋白;圖B GST-STEAP4-like的純化。M:預染蛋白 marker;1:16 ℃誘導的上清蛋白;2和3:純化后的GST-STEAP4-like蛋白

3 討論

STEAP4可調控鐵和銅的穩態,與細胞炎癥應激反應、代謝性疾病與前列腺癌、結腸癌等多種癌癥的發生有關[10,11,13,16]。本研究克隆了擬穴青蟹STEAP4-like(Sp-STEAP4-like)cDNA序列,其ORF長1 443 bp,編碼 480個氨基酸,預測蛋白大小為52.6 kDa,共有9個NAD結合位點(G62、S63、G64、F66、G84、S85、R86、A18、V19),第60—142位氨基酸和第292—412位氨基酸有與美洲螯龍蝦相似的NADP氧化還原酶輔酶和鐵還原酶結構域。通過氨基酸多序列比對,發現Sp-STEAP4-like與三疣梭子蟹STEAP4-like相似性最高,為86.46%。系統進化樹結果表明,擬穴青蟹STEAP4-like與三疣梭子蟹和突眼蟹聚為一支,親緣關系最為接近。

在哺乳動物中,STEAP4基因主要在脂肪組織、胎盤、骨髓、肺、胰腺和心臟中表達, 參與代謝過程并與代謝性疾病相關,與前列腺癌、結腸癌等多種癌癥的發生有關,而且STEAP4在細胞存活、增殖和凋亡中也起著重要作用[20]。本研究應用qRT-PCR 技術對STEAP4-like基因在擬穴青蟹各組織中的表達量進行檢測分析,結果顯示STEAP4-like基因在胃、內皮、肌肉、血淋巴和鰓組織中均有表達,且在肌肉中表達量最高,在內皮中的表達量最低?；蛟诮M織中的特異性表達大多與其功能密切相關,而擬穴青蟹STEAP4的生物學功能有待進一步探究。

關于水生動物STEAP4的功能研究極為匱乏,僅有少數研究表明,STEAP4通過調節鐵的含量,影響賽內加爾鰨的免疫能力[21]。在微囊藻毒素刺激下,鰱STEAP4的表達水平顯著性上調,STEAP4可能在魚類的炎癥反應、代謝反應和系統動態平衡中發揮重要作用[22]。WSSV是蝦蟹養殖產業中常見的致病性病毒,致病性強,致死率高[3,23]。本研究發現WSSV感染擬穴青蟹后,STEAP4-like基因顯著性下調表達,說明STEAP4-like基因可能參與調控擬穴青蟹抗WSSV感染免疫反應。而此結果與鰱在微囊藻毒素刺激后STEAP4顯著性上調表達相反,說明脊椎動物與無脊椎動物STEAP4-like功能可能存在差異性,且需要進一步的研究。除此之外,本實驗構建了pGEX-6P-1-STEAP4-like重組表達載體,表達并純化了重組蛋白GST-STEAP4-like,為制備多克隆抗體與探究互作蛋白等后續研究奠定基礎。

4 結論

綜上,本研究首次克隆了擬穴青蟹的STEAP4-like基因,檢測分析了STEAP4-like基因在擬穴青蟹各組織中的表達量,其在各組織中均有表達,且在肌肉中表達量最高。WSSV感染青蟹后,STEAP4-like顯著性下調表達。表明STEAP4-like基因可能參與調控擬穴青蟹抗WSSV感染免疫反應。構建原核重組表達載體,表達并純化了重組蛋白GST-STEAP4-like。研究結果為探究無脊椎動物STEAP4-like功能及進一步了解擬穴青蟹抗WSSV的免疫反應機制奠定基礎。