計算機輔助模擬技術在脲酶抑制劑篩選中的應用*

謝勇飛, 束維正, 李慧敏, 胡婷婷, 陳 駿

(中鹽安徽紅四方肥業股份有限公司 安徽合肥 231602)

0 前言

脲酶是一種能夠催化尿素水解的土壤含鎳酶。 尿素進入土壤后,酰胺態氮并不能被作物直接吸收利用,脲酶可催化酰胺態氮水解為銨態氮,作物以銨態氮或硝態氮形式吸收轉化氮營養元素[1]。 尿素過快轉化為銨態氮會造成氨揮發,降低了施入土壤的氮素利用率。 脲酶抑制劑可與尿素形成競爭性抑制,減少尿素的過量轉化,降低尿素的水解速率,減緩銨態氮的揮發和硝化過程。

研究發現,脲酶抑制劑的作用機制包括以下4 個方面:一是脲酶抑制劑競爭占居了土壤中脲酶催化活性中心位置,減少了尿素與脲酶結合的概率,降低了酶的活性;二是脲酶抑制劑多具有還原性,還原性物質可改變土壤氧化水平,減弱脲酶在土壤中的催化效果;三是部分脲酶抑制劑為脲酶生物合成抑制劑,可減弱合成脲酶的微生物的代謝,使脲酶生物合成過程受阻,減少土壤中脲酶的含量,參與反應的尿素變少,水解速率降低;四是選擇與尿素結構相似的化合物,使其在隨水移動的過程中與脲酶發生作用,替代尿素進行分解或結合,起到保護尿素不被分解的目的。 田間施用尿素的同時追施一定量的脲酶抑制劑,可有效降低土壤中脲酶的活性,減緩尿素的分解速率,減少土壤中氨的揮發,減弱對銨的硝化作用。

脲酶抑制劑發揮作用需要土壤具備適當的條件。 影響脲酶抑制劑活性的因素包括土壤的酸堿度、通透性、有機物含量、水含量等,同時需要考慮土壤中尿素含量。 脲酶抑制劑的種類較多,作用的環境條件也不同。 如苯基磷酰二胺(PPD)是一種被認為有潛力的脲酶抑制劑,對酸堿度比較敏感,容易分解形成酚類物質,而酚是一種比較弱的脲酶抑制劑。 對苯二酚(HQ)在通氣性良好的條件下使用時,效果比正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)和PPD 差。 NBPT 受土壤酸堿度的影響相對較小,有文獻報道,在堿性土壤中更適合使用NBPT[2]。 因此,各種脲酶抑制劑由于作用機制、土壤作用條件不同,使用方法也不同,但在脲酶活性高的土壤上施用脲酶抑制劑,抑制作用較好。

NBPT 和HQ 是兩種研究較多的脲酶抑制劑。HQ 通過減少尿素的水解以降低氨的揮發和硝化作用,提高了酰胺態氮的利用率,延長了銨態氮對作物的有效持續供應時間并減少了損失。 邢衛等[3]的研究發現,在土壤中施用尿素,當NBPT 的用量為尿素氮的0.2%時,可直接減少氨的揮發損失,延長銨態氮的持續供應時間。 與普通尿素相比,NBPT 增效劑尿素能顯著增加春油菜的角果數和角粒數,春油菜折合產量為4 075.6 kg/hm2,較對照不施氮肥處理的增產2 425.6 kg/hm2,增產率為147.0%;較施氮135 kg/hm2處理的增產367.6 kg/hm2,增產率為9.9%[4]。

趙略等[5]研究了NBPT 對土壤中脲酶活性和細菌、放線菌生長及發酵產酶的影響,結果表明:NBPT 的質量分數為0.1%～0.5%時,對土壤中脲酶的活性影響較小;當NBPT 的質量分數達到1.0%時,對氨的揮發抑制效果最顯著;低質量濃度(0.1 mg/mL)的NBPT 對細菌等菌種的生長有一定的促進作用,但是中等質量濃度和高質量濃度處理組表現出了菌種生長受到抑制的現象;NBPT 對放線菌、細菌的產酶有非常明顯的抑制效果,最大抑制率分別為55.5%和67.2%。

當前對脲酶抑制劑的研究,有些側重于農作物的產量、土壤銨含量和氨揮發等方面,有些則側重于抑制劑的作用機制,結果都表明脲酶抑制劑在抑制尿素水解、提升氮肥利用率方面具有顯著效果。 脲酶抑制劑是化學試劑,存在生產成本高、價格高、田間降解能力弱、對作物有化學污染等缺點,如HQ 不僅價格較貴,而且有毒,人食用5 g 即可致死,需慎重考慮其生物安全性。

脲酶抑制劑多為有機化合物,受環境影響較大,施用上具有一定的局限性,在選擇脲酶抑制劑時,需了解土壤的狀況和周圍的環境情況。 因此,尋找一種既可起到抑制脲酶活性和尿素水解,又適用于大多數土壤,且對環境友好的化合物成為一種需求。

1 研究方法

1.1 脲酶晶體結構準備

從PDB 數據庫(https:/ /www. rcsb. org)獲取4gy7 菜豆脲酶的晶體結構。 利用PyMOL 軟件,保留蛋白的A 鏈和C 鏈,除去其他鏈和水分子。在AutoDock 4.2 軟件中,將準備好的pdb 格式文件添加氫原子并對氨基酸殘基進行補齊,計算電荷,設置原子類型為Assign AD4 type。 利用PyMOL 軟件,從蛋白晶體復合物中提取出共晶配體,以該配體所在的雙鎳活性位點作為活性中心,打開pdb 格式文件,設置Grid 參數,以蛋白的活性位點為中心;設置x=50、y=50、z=50,x、y、z分別表示在各方向上格點的數量;Spacing 設置為0.3×10-10m,設置完成后保存為grid. gpf 格式文件。

1.2 天然產物活性小分子結構準備

通過ZINC 數據庫下載天然化合物,先使用ChemDraw 軟件繪制出單體化合物的結構,再用Caculations-MM2-Minimize Energy 模塊對小分子化合物進行能量優化,并保存成mol2 格式。 在Autodock 軟件的Read Molecule 中,選擇mol 文件并打開后,導入配體小分子。 將mol2 格式批量轉換為pdbqt 格式。

1.3 分子對接準備

在AutoDockTools 中的Docking 模塊打開保存好的pdbqt 格式文件,定義配受體,Search Parameters 選擇遺傳算法(Genetic Algorithm),Number of GA Runs 設置為10,Maximum Number of Evals 設置為250 000,其他參數為默認,輸出文件保存為dock. dpf 格式文件,通過run AutoDock生成dlg 格式文件。 在AutoDockTools 的Analyze板塊中對dlg 格式文件進行分析,保存最優構象后輸出pdb 格式文件。

1.4 相互作用能分析

將分子對接獲得的最佳分子構象pdb 格式文件進行MM-PBSA 分子間相互作用力分析,并與脲酶抑制劑NBPT 和HQ、(2-硝基苯基)-磷酸三酰胺(2-NPT)和ZINC 數據庫化合物等進行分子間作用力評估,評估的結果以結合能數據表示。

2 模擬結果

2.1 脲酶晶體和小分子結構準備

菜豆脲酶為三聚體蛋白質,晶體結構去除水分子后,僅保存A、C 鏈,A、C 鏈各包含840 個氨基酸,菜豆脲酶的分子結構見圖1,氨基酸序列見圖2。 活性中心根據原配體所在位置,刪除原有配體,選取原有配體及雙鎳活性中心9×10-10m范圍內的腔體作為活性中心,見圖3。

圖1 菜豆脲酶的分子結構

圖2 菜豆脲酶氨基酸序列

圖3 雙鎳活性中心

小分子配體準備:經ZINC 數據庫分析,累計下載9 617 個小分子,同時下載尿素、NBPT、HQ、2-NPT 的分子作為對照,所有小分子通過分子動力學軟件進行能量最小化優化。

2.2 配體半柔性分子對接

使用經能量最小化優化后的小分子與脲酶蛋白晶體結構進行半柔性分子動力學優化,再經MM-GBSA 進行相互作用的結合能分析。 尿素、NBPT、HQ、2-NPT 與脲酶相互作用的平均結合能依次為30.91、32.92、28.36、18.63 kJ/mol,見表1;作用的主要氨基酸及金屬催化中心為Ni1、Ni2、ALA A:440、ASP A:633、GLY A:550、HIS A:409、ALA A:636、KCX A:490、HIS A:492、HIS A:519、HIS A:593、ARG A:609、MET A:637、CME A:592 等,作用的類型主要為范德華力、氫鍵、金屬配位、電荷吸引力等,見圖4～7。

表1 尿素和常用脲酶抑制劑與脲酶相互作用的結合能kJ/mol

圖4 尿素與脲酶抑制劑作用情況分析

2.3 基于ZINC 數據庫的有效產物篩選

使用ZINC 數據庫,共下載9 617 個小分子,再經Minimize Energy 處理,得到優化后的小分子,賦予charmm 力場。 優化后的小分子和脲酶蛋白晶體結構經過半柔性分子動力學優化,獲得5 883 個小分子具有可能的結合能力;然后經MM-GBSA 相互作用能分析,以平均結合能大于55 kJ/mol 的分子作為考察對象,見表2。

表2 平均結合能大于50 kJ/mol 的潛在化合物

圖5 NBPT 與脲酶抑制劑作用情況分析

圖6 2-NPT 與脲酶抑制劑作用情況分析

圖7 HQ 與脲酶抑制劑作用情況分析

3 討論

3.1 尿素、NBPT、HQ、2-NPT 分子對接

通過分子對接,結果顯示:尿素、NBPT、HQ、2-NPT 與脲酶相互作用的平均結合能依次為30.91、32.92、28.36、18.63 kJ/mol,平均結合能數據表現為NBPT＞HQ＞2-NPT,NBPT 的效果最優。徐麗萍等[6]的研究發現,NBPT 能抑制酰胺態氮的水解,降低氨揮發量,其中在潮土中NBPT 的抑制作用最顯著,在紅壤中的抑制作用最弱,可能是因為NBPT 在酸性土壤中的降解導致抑制效果減弱。 寧國輝等[7]發現,NBPT 對于抑制尿素在土壤中的水解比HQ 或P-苯醌更有效。 HQ 對的揮發抑制作用最小,可能與其對硝化作用的抑制有關,與土壤環境因素無關。 HQ 的作用不僅在于延緩尿素的水解和減少氨的揮發,更重要的是影響了尿素水解產物進一步轉化的過程[8]。 2-NPT 作為新型脲酶抑制劑,具有較高的有效性,對脲酶的作用也具有耐久效應[9]。 俄羅斯于2016 年發布了《采用高效液相色譜法測定尿素和含尿素肥料中的N-(2-硝基苯基)磷酸三酰胺(2-NPT)》的標準,為后期的化合物設計提供了依據,同時需嚴格規避化合物的毒理作用,避免對人或作物產生毒害作用,開發天然、環保、毒副作用小的脲酶抑制劑是環保、作物高效利用的關鍵。

3.2 新型脲酶抑制劑的虛擬篩選

ZINC 數據庫中共下載9 617 個小分子,經Minimize Energy 處理得到優化后的小分子,賦予charmm 力場,通過分子動力學優化、MM-GBSA 分析,獲得5 883 個小分子與脲酶可能產生相互作用。 表2 中所示化合物平均結合能大于55 kJ/mol,優于尿素、NBPT、HQ 的結合能,在相互作用能層面上具有較好的結果,結合的活性位點與DMPP、NBPT 等具有相同點,可在后期針對結構位點進行深度的虛擬突變和化合物分子骨架延長設計。

4 結語

通過對脲酶晶體結構、尿素與脲酶的結合以及NBPT、HQ 等常規脲酶抑制劑進行分子對接處理,結果表明:NBPT 效果優于HQ 和2-NPT,作為脲酶抑制劑可對尿素產生有效的競爭;對于ZINC數據庫中9 617 個篩選出的小分子,5 883 個小分子具有與脲酶相互作用的關系,其中平均結合能

基于分子對接尋找酶抑制劑的方法一直是新藥開發的重點,中鹽安徽紅四方肥業股份有限公司通過與高校院所產學研合作,持續性地在肥料領域加強科研攻關力度,通過先進的篩選方法,快速有效地提升脲酶抑制劑的篩選速度;通過開展實驗室測定、田間試驗示范,驗證了不同增效劑在氮肥增效上的應用價值。 后期將進行相關理論數據的補充驗證,尋找成本低、穩定性好、自然環保的脲酶抑制劑,持續性地推進脲酶抑制劑在氮肥增效上的應用與開發。