基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)白術(shù)多糖干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的代謝組學(xué)研究

楊 慧，蔣且英，劉 漩，李龔龍，廖正根*

基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)白術(shù)多糖干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的代謝組學(xué)研究

楊 慧1，蔣且英2，劉 漩2，李龔龍1，廖正根1*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，江西 南昌 330004

研究白術(shù)多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）小鼠的影響，探討白術(shù)多糖干預(yù)UC的代謝途徑及可能的作用機(jī)制。采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)小鼠UC模型，給予白術(shù)多糖或美沙拉嗪干預(yù)后，測(cè)定小鼠體質(zhì)量、疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分及結(jié)腸長(zhǎng)度；采用ELISA檢測(cè)小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）水平及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MOP）活性；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察結(jié)腸組織病理變化；采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）檢測(cè)小鼠血清內(nèi)源性代謝物水平，并結(jié)合主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析對(duì)差異代謝物進(jìn)行表征，篩選出潛在的差異代謝物；采用MetaboAnalyst 5.0網(wǎng)址分析可能的代謝通路。白術(shù)多糖顯著改善UC小鼠的癥狀和結(jié)腸組織病理?yè)p傷，提高血清中IL-10水平和SOD活性（＜0.05、0.01），降低TNF-α水平和MPO活性（＜0.05、0.01），并通過(guò)α-亞麻酸代謝通路、類固醇激素生物合成通路、初級(jí)膽汁酸生物合成通路、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A生物合成通路、不飽和脂肪酸生物合成通路等代謝途徑回調(diào)UC小鼠的異常代謝產(chǎn)物。白術(shù)多糖具有防治UC的作用，其機(jī)制可能與平衡促炎因子與抗炎因子、增強(qiáng)抗氧化和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等通路相關(guān)。

白術(shù)多糖；潰瘍性結(jié)腸炎；代謝組學(xué)；促炎因子；抗炎因子；氧化應(yīng)激；脂質(zhì)代謝

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種腸道非特異性、慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性疾病，主要特征為結(jié)腸黏膜上皮損傷和腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞，表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、腹痛、帶血黏液腹瀉、直腸萎縮，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，UC在我國(guó)患病率逐年增加[1]。目前常用的UC治療藥物包括氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑[2]，然而，這些藥物往往伴隨著不良反應(yīng)，且部分患者仍需要手術(shù)，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)安全有效的防治UC的藥物。

白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水的功效，用于脾虛食少、腹脹泄瀉等有近數(shù)千年歷史，其主治證候與UC一致，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明白術(shù)具有抗UC的作用[3]。白術(shù)作為一種重要的補(bǔ)益類中藥，多糖是其重要活性成分，主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖和半乳糖等組成[4]。UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有定性定量準(zhǔn)確、覆蓋面廣、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)的非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)為從整體上揭示藥物作用機(jī)制提供了可能。故本研究在證實(shí)白術(shù)多糖具有抗UC作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用代謝組學(xué)技術(shù)探討其對(duì)UC的作用機(jī)制，為白術(shù)多糖用于UC防治提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠72只，8周齡，體質(zhì)質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度22～24 ℃、相對(duì)濕度50%～60%的屏障環(huán)境中，12 h光照/黑暗交替，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科技中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)JZLLSC20230350）。

1.2 藥材

白術(shù)飲片（批號(hào)04）產(chǎn)地為安徽省鹿邑縣鄭集市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)張壽文教授鑒定為菊科植物白術(shù)Koidz.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)110833~201908）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS，批號(hào)160110）購(gòu)自美國(guó)MP公司；美沙拉嗪腸溶片（批號(hào)210706）購(gòu)自葵花藥業(yè)佳木斯鹿靈制藥有限公司；糞便隱血定性檢測(cè)試劑盒（匹拉米洞法，批號(hào)1031A22）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20221206）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MOP）試劑盒（批號(hào)20221205）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（批號(hào)H009-1-2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)H052-1-2）均購(gòu)自南京建成生物有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號(hào)20221129）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 儀器

TripleTOF5600型高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；BAS124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀（南昌樹(shù)森實(shí)業(yè)有限公司）；PLUS-E2-10TH型實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水機(jī)（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；真空干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 白術(shù)多糖的制備

取白術(shù)飲片100 g，粉碎，加10倍量蒸餾水，回流提取3次，每次2 h，趁熱濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至含生藥0.2 g/mL，乙醇醇沉，醇沉終體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃靜置24 h后真空抽濾，依次用無(wú)水乙醇-丙酮-石油醚（60～90 ℃）-無(wú)水乙醇洗滌沉淀，揮干有機(jī)試劑得淡黃色白術(shù)粗多糖。白術(shù)粗多糖用100 mL蒸餾水溶解，并與Sevage試劑（氯仿-正丁醇4∶1）按1∶3混合攪拌25 min，4000 r/min離心10 min，重復(fù)多次，直至無(wú)蛋白沉淀物。將上清液轉(zhuǎn)移到透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量8000～14 000）中，分別在自來(lái)水、雙蒸水中各透析24 h，透析過(guò)程中每隔2 h換水。透析結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥，最終得到白色粉末狀白術(shù)多糖，采用相同的方法制備3次，共得到白術(shù)多糖12.78 g。

2.2 多糖含量的測(cè)定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105 ℃干燥至恒定質(zhì)量的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于具塞試管中加水至2 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40 ℃水浴保溫15 min，取出后冰水浴10 min，放置室溫作為樣品。以水經(jīng)過(guò)相同處理后為空白對(duì)照，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（）值，以葡葡萄糖含量為橫坐標(biāo)（），以490值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 多糖含量的測(cè)定 精密稱取干燥多糖樣品5 mg，蒸餾水定容至100 mL量瓶中，采用苯酚-硫酸法，移取白術(shù)多糖溶液0.8 mL，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，用紫外-分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，平行3次，取平均值，測(cè)得值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算總糖含量。

2.3 動(dòng)物造模與給藥

BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及白術(shù)多糖低、中、高劑量（60、100、200 mg/kg）組和美沙拉嗪（300 mg/kg）組，實(shí)驗(yàn)組每組12只。對(duì)照組每日飲用蒸餾水，其余組連續(xù)12 d自由飲用2.5% DSS溶液。從造模第1天起，各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)12 d。

2.4 小鼠一般狀態(tài)及疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分測(cè)定

每日記錄小鼠體質(zhì)量、精神活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)光澤、大便性狀和便血情況，進(jìn)行DAI評(píng)分[5]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

DAI＝體質(zhì)量降低評(píng)分＋大便性狀評(píng)分＋便血評(píng)分

表1 DAI評(píng)分

2.5 小鼠血清炎性因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血于抗凝管中，3500 r/min（離心半徑10 cm）離心15 min，取上清液，?80 ℃保存?zhèn)溆谩０丛噭┖姓f(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-10水平及SOD、MPO活性。

2.6 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

小鼠給予異氟烷安樂(lè)死，迅速取出結(jié)腸，稱定質(zhì)量并記錄結(jié)腸長(zhǎng)度，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、HE染色后封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 代謝組學(xué)血清樣本制備

取?80 ℃保存的血清樣本，4 ℃解凍。取100 μL血清樣本于2 mL離心管中，加入300 μL含0.1%甲酸的甲醇，渦旋60 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，室溫下真空濃縮干燥至干。殘?jiān)尤?0 μL 70%甲醇復(fù)溶，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，待測(cè)。

2.8 質(zhì)譜條件

利用UHPLC-Q-TOF-MS正離子模式采集血清樣本，Ultimate UHPLC XB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫：0～8 min，10%～60% B；8～30 min，60%～95% B；30～32 min，95% B；32～37 min，95%～10% B；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。采用ESI電噴霧離子源，掃描范圍/100～1500；噴霧電壓5.5 kV；離子源溫度500 ℃；去簇電壓100 V；碰撞能量45 eV；碰撞能量疊加15 eV；氣簾氣壓力275.8 kPa；霧化氣（GS1）和輔助氣（GS2）壓力均為344.8 kPa；數(shù)據(jù)采集時(shí)間37 min，采用TOF-MS-IDA-MS/MS方式采集數(shù)據(jù)。

2.9 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 多糖含量測(cè)定

采用苯酚硫酸法檢測(cè)白術(shù)多糖的總糖含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為＝0.007 8＋0.199，2＝0.998 1，計(jì)算得到白術(shù)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.9%。

3.2 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠體質(zhì)量變化率、DAI評(píng)分和結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好；模型組小鼠毛色暗淡，出現(xiàn)懶動(dòng)、血便、稀便等狀況。經(jīng)美沙拉嗪及白術(shù)多糖干預(yù)后，UC小鼠上述狀況均有所改善。如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（＜0.01），DAI評(píng)分顯著升高（＜0.01），結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短（＜0.01）；與模型組比較，美沙拉嗪組小鼠體質(zhì)量顯著升高（＜0.01），DAI評(píng)分顯著降低（＜0.01），結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增加（＜0.01）；白術(shù)多糖各劑量組小鼠體質(zhì)量均顯著升高（＜0.05），白術(shù)多糖中、高劑量組小鼠DAI評(píng)分均顯著降低（＜0.05、0.01），結(jié)腸長(zhǎng)度均顯著增加（＜0.01）。

3.3 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠血清中炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中MPO活性和TNF-α水平均顯著升高（＜0.01），SOD活性和IL-10水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中MPO活性和TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01），SOD活性和IL-10水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.4 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

如圖3所示，模型組小鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)潰瘍，隱窩消失，杯狀細(xì)胞溶解，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；白術(shù)多糖中劑量組黏膜充血，但杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整；美沙拉嗪組及白術(shù)多糖高、低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜未見(jiàn)潰瘍及充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，炎癥得到改善。

N-對(duì)照組 M-模型組 P-美沙拉嗪組 AMPH-白術(shù)多糖高劑量組 AMPM-白術(shù)多糖中劑量組 AMPL-白術(shù)多糖低劑量組 與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠血清中炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響(, n = 12)

箭頭表示炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

3.5 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠血清代謝組學(xué)的影響

3.5.1 血清代謝圖譜 應(yīng)用UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行血清樣品的分離和數(shù)據(jù)采集，得到各組小鼠血清代謝圖譜（圖4），各組樣品總離子流圖基本相似，但各組峰形及峰面積存在一定差異，表明小鼠體內(nèi)部分代謝物發(fā)生變化。

3.5.2 代謝輪廓分析 采用PCA分別對(duì)血清的代謝輪廓進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。各組樣本聚集在95%的置信區(qū)間內(nèi)，分為3類，其中對(duì)照組、美沙拉嗪組和白術(shù)多糖高、低劑量組為1類，模型組為1類，白術(shù)多糖中劑量組為一類，分離程度較高，說(shuō)明3組代謝物組間差異較大。經(jīng)DSS誘導(dǎo)后，模型組獨(dú)自位于一側(cè)，提示代謝物的種類或水平發(fā)生了顯著變化；給予藥物干預(yù)后，白術(shù)多糖高、低劑量組及美沙拉嗪組明顯向?qū)φ战M靠近。白術(shù)多糖中劑量組被分為另外一類，但和模型組還是存在明顯的分類差別，說(shuō)明白術(shù)多糖中劑量組也對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠存在治療作用，只是和白術(shù)多糖高、低劑量組表達(dá)程度不同，代謝輪廓結(jié)果與體質(zhì)量變化率、炎癥因子測(cè)定和病理切片的結(jié)果相呼應(yīng)，說(shuō)明給藥無(wú)量效關(guān)系。

圖4 各組樣品總離子流圖

圖5 各組樣品PCA得分圖

3.5.3 OPLS-DA 在PCA的基礎(chǔ)上進(jìn)行OPLS-DA，模型組與各給藥組完全分離，為防止模型出現(xiàn)過(guò)擬合，對(duì)模型進(jìn)行200次隨機(jī)置換檢驗(yàn)，血清樣品的2所在回歸線與軸的截距均小于0，表明模型質(zhì)量良好。S-plot載荷圖能夠鑒定出導(dǎo)致組間差異的代謝物，圖中的點(diǎn)距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明此化合物對(duì)分組的影響越大，Scatter圖綜合了VIP值，其離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明此化合物為顯著的差異代謝物，二者可以同時(shí)表征血清組間的差異代謝物（圖6）。

3.5.4 差異代謝物的鑒定 根據(jù)峰面積、FC及值構(gòu)建火山圖，見(jiàn)圖7，根據(jù)VIP＞1篩選出差異代謝物，再根據(jù)文獻(xiàn)及HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)在小鼠血清中鑒定出59個(gè)差異代謝物，見(jiàn)表2。

3.5.5 代謝通路分析 將獲得的差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行通路分析，結(jié)果見(jiàn)圖8，以impact＞0.1、＜0.05為目標(biāo)，篩選出與白術(shù)多糖干預(yù)UC小鼠相關(guān)通路，影響最強(qiáng)的分別為α-亞麻酸代謝通路、類固醇激素生物合成通路、初級(jí)膽汁酸生物合成通路、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A生物合成通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路。

圖6 各組OPLS-DA得分圖、200次置換檢驗(yàn)圖、S-plot載荷圖及Scatter圖

A-對(duì)照組vs模型組 B-模型組vs美沙拉嗪組 C-模型組vs白術(shù)多糖高劑量組 D-模型組vs白術(shù)多糖中劑量組 E-模型組vs白術(shù)多糖低劑量組

表2 各組樣品血清差異代謝物

續(xù)表2

“↑”表示模型組上調(diào)，“↓”表示模型組下調(diào)

“↑” means that the model group is up-regulated, and “↓” means that the model group is down-regulated

4 討論

4.1 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠血清氧化應(yīng)激的影響

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是UC發(fā)展的重要因素，在結(jié)腸炎癥區(qū)域，由于炎癥介質(zhì)的增多和抗炎因子的減少[6]，一方面，會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生和釋放大量活性氧；另一方面又會(huì)使清除自由基的SOD等酶活性降低，兩者均會(huì)使活性氧不斷積累，從而引起結(jié)腸組織的損傷，這是UC的一種潛在致病因素[7]。MPO是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的一種成分，可產(chǎn)生高水平的活性氧。MPO在臨床上常被用作觀察中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到腸黏膜的標(biāo)志物[8]。本研究結(jié)果顯示，白術(shù)多糖能夠顯著降低UC小鼠MPO活性，提高SOD活性，表明抗氧化損傷是白術(shù)多糖防治UC的機(jī)制之一。

4.2 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠血清炎性因子的影響

TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的強(qiáng)促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)氧氮介質(zhì)釋放，或直接激發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使上皮細(xì)胞惡變，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要作用[9]。IL-10是由Treg細(xì)胞、Th2細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的抑炎因子[10]，本研究結(jié)果表明白術(shù)多糖能夠顯著抑制UC小鼠血清中TNF-α水平，并明顯提高抗炎因子IL-10水平，抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)，因此，調(diào)節(jié)抗炎與促炎因子的平衡，可能是白術(shù)多糖防治UC的又一機(jī)制。

4.3 白術(shù)多糖對(duì)UC小鼠血清代謝產(chǎn)物及代謝通路的影響

基于UHPLC-Q-TOF-MS對(duì)UC小鼠血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，在樣本中鑒定得到59個(gè)差異代謝物，主要包括7種脂肪酸衍生物、3種膽汁酸、4種類固醇脂質(zhì)分子、7種不飽和脂肪酸、12種酰基肉堿、9種溶血磷脂酰膽堿、5種溶血磷脂酰乙醇胺和其他化合物。與對(duì)照組比較，模型組59種代謝物均異常表達(dá)，提示UC小鼠體內(nèi)代謝水平紊亂；經(jīng)白術(shù)多糖以及美沙拉嗪干預(yù)后，發(fā)生改變的代謝物水平均有不同程度的回調(diào)，主要涉及α-亞麻酸代謝通路、類固醇激素生物合成通路、初級(jí)膽汁酸生物合成通路、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A生物合成通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路等代謝通路。通過(guò)對(duì)比模型組和白術(shù)多糖給藥組的代謝物水平，發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖給藥后小鼠血清代謝物水平整體趨向于對(duì)照組和美沙拉嗪組，提示白術(shù)多糖與美沙拉嗪類似，可能通過(guò)改善相關(guān)代謝過(guò)程，發(fā)揮治療UC的作用。

4.4 白術(shù)多糖影響的UC小鼠血清代謝產(chǎn)物及代謝通路與表型的關(guān)系

磷脂酰膽堿（phosphatidylcholines，PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）等甘油磷脂是生物膜的主要脂質(zhì)成分，在維持膜結(jié)構(gòu)、保證膜結(jié)合蛋白、離子通道和受體的正常運(yùn)作過(guò)程中發(fā)揮重要作用，由不同長(zhǎng)度和飽和度的脂肪酸組合而成[11-12]，在腸炎過(guò)程中常發(fā)生甘油磷脂代謝異常[13-14]。PC在磷脂酶A2作用下水解產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿[15]。溶血磷脂酰膽堿作為趨化介質(zhì)，可通過(guò)特異性G蛋白偶聯(lián)受體對(duì)免疫細(xì)胞活化的修飾從而參與炎癥過(guò)程[16]。溶血磷脂酰膽堿含量過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致磷脂代謝紊亂[17]，并進(jìn)一步損傷細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致組織損傷。由于甘油磷脂的C-2通常連接不飽和脂肪酸，因此，甘油磷脂在磷脂酶A2的作用下導(dǎo)致溶血磷脂增加的同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致不飽和脂肪酸增加。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組不飽和脂肪酸、溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺差異代謝物表達(dá)均升高，而白術(shù)多糖給藥后其含量顯著下調(diào)，提示白術(shù)多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)甘油磷脂和不飽和脂肪酸代謝，減輕細(xì)胞膜損傷，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)結(jié)腸的屏障功能，從而改善UC小鼠的體質(zhì)量變化率、DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸組織病理變化等表型。

類固醇激素和初級(jí)膽汁酸合成途徑從膽固醇開(kāi)始，本研究中模型組19-去甲雄甾酮、硫酸表雄酮、醛固酮等4種類固醇代謝物以及考膽酸、3α,7α-二羥基考前列烷酸、10-氧代十八烷酸3種膽汁酸代謝物顯著上調(diào)。類固醇激素通過(guò)與特定的細(xì)胞內(nèi)受體相結(jié)合，通過(guò)刺激核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]來(lái)促進(jìn)TNF-α的形成，抑制IL-10的形成，從而促進(jìn)炎癥發(fā)生；膽汁酸代謝紊亂在腸道炎癥中起著重要作用[19]，可激活與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)的法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）[20-21]。NF-κB調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，可誘導(dǎo)TNF-α的生成[22]。TNF不僅可以誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，還可觸發(fā)細(xì)胞死亡，調(diào)控炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制[23]。本研究結(jié)果表明，給予白術(shù)多糖后，以上代謝產(chǎn)物均回調(diào)，提示白術(shù)多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)類固醇激素和初級(jí)膽汁酸生物合成通路抑制NF-κB途徑，調(diào)節(jié)抑炎與促炎因子的平衡，減少炎癥細(xì)胞損傷，從而改善UC。

中藥量效關(guān)系仍處于經(jīng)驗(yàn)積累階段[24]，白術(shù)多糖高、中、低劑量組在防治DSS誘導(dǎo)的UC均有明顯的效果，但是白術(shù)多糖不同劑量組在體質(zhì)量變化率、DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、氧化應(yīng)激、病理?yè)p傷、和代謝組學(xué)分類結(jié)果方面沒(méi)有顯示出明顯的劑量相關(guān)性，白術(shù)多糖中劑量組代謝輪廓結(jié)果與體質(zhì)量變化率、DAI評(píng)分和氧化應(yīng)激等表型結(jié)果相呼應(yīng)，提示白術(shù)多糖給藥不存在明顯的量效關(guān)系。

綜上，白術(shù)多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物來(lái)平衡促炎因子與抗炎因子，增強(qiáng)抗氧化和調(diào)控脂質(zhì)、類固醇等相關(guān)代謝通路，從而干預(yù)UC的發(fā)展，為多糖用藥的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Metabolomic study ofpolysaccharide intervention in ulcerative colitis based on UPLC-Q-TOF-MS technology

YANG Hui1, JIANG Qie-ying2, LIU Xuan2, LI Gong-long1, LIAO Zheng-gen1

1. Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Experimental Animal Science and Technology Center, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To study the effects ofpolysaccharide (AMP) on ulcerative colitis (UC) mice, and investigate the metabolic pathways and possible mechanisms of AMP intervention in UC.A mice UC model was induced with dextran sulfate sodium (DSS), after the intervention of AMP or mesalazine, body weight, disease activity index (DAI) score and colon length were recorded; Levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-10 (IL-10) and activities of superoxide dismutase (SOD), myeloperoxidase (MOP) in serum of mice were measured by ELISA; HE staining was used to observe the pathological changes of colon tissue; The levels of endogenous metabolites in serum of mice were detected by ultra performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS), the differential metabolites were characterized by principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis, and the potential differential metabolites were screened out. The website of MetaboAnalyst 5.0 was used to analyze the possible metabolic pathways.AMP significantly improved the symptoms and pathological damage of colon tissue in UC mice, increased IL-10 level and SOD activity in serum (< 0.05, 0.01), decreased TNF-α level and MPO activity (< 0.05, 0.01), modulated the abnormal metabolites in UC mice by α-linolenic acid, steroid hormone biosynthesis, primary bile acid biosynthesis, glycerophospholipid metabolism, pantothenic acid and coenzyme A biosynthesis and unsaturated fatty acid biosynthesis metabolic pathways.AMP has a preventive and curative effect on UC, and its mechanism may be related to balancing pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors, enhancing antioxidation and regulating lipid metabolism.

polysaccharide; ulcerative colitis; metabolomics; pro-inflammatory factors; anti-inflammatory factors; oxidative stress; lipid metabolism

R285.5

A

0253 - 2670(2023)15- 4895 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.015

2023-04-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81660757）；江西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（x202310412247）

楊 慧（1999—），女，碩士研究生，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: 18228548353 E-mail: 2316359352@qq.com

通信作者：廖正根（1967—），男，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥新劑型新技術(shù)與體內(nèi)過(guò)程評(píng)價(jià)研究。 Tel: (0791)87118658 E-mail: lyzlyg@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]