不同產地老鸛草指紋圖譜的建立及抗腫瘤譜效關系研究

孫仁爽，趙敏婧

不同產地老鸛草指紋圖譜的建立及抗腫瘤譜效關系研究

孫仁爽1，趙敏婧2

1. 通化師范學院醫藥學院（長白山天然藥物重點實驗室），吉林 通化 134001 2. 梅河口市食品藥品檢驗檢測中心，吉林 梅河口 135000

建立老鸛草指紋圖譜，研究老鸛草提取物的指紋圖譜與抗腫瘤活性之間的譜效關系，初步明確老鸛草抗腫瘤主要活性成分。運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件，建立老鸛草抗腫瘤活性部位的HPLC指紋圖譜。采用MTT法，以人乳腺癌MCF-7細胞為模型，對老鸛草樣品的醋酸乙酯部位進行抗腫瘤活性測定。采用多元線性回歸法，將量化共有峰面積與MTT法測得老鸛草抗腫瘤活性結果相結合，構建老鸛草抗腫瘤譜效關系。通過指紋圖譜的建立，共標定了16個共有峰，確定1號峰為沒食子酸、7號峰為柯里拉京、8號峰為老鸛草素、12號峰為鞣花酸。其中29批藥材的相似度均大于0.732，運用主成分分析和聚類分析進一步分析樣品間差異，將距離較遠的30號樣品排除。HPLC指紋圖譜中的16個共有峰中，有8個峰對MCF-7細胞有作用，得到MCF-7的譜效方程，經6批藥材驗證，譜效方程計算值與實際值的偏差率不超過10%。該譜-效方程可用于預測老鸛草的抗乳腺癌作用物質基礎。

老鸛草；指紋圖譜；抗腫瘤；譜效關系；沒食子酸；柯里拉京；老鸛草素；鞣花酸

老鸛草為牻牛兒苗科植物老鸛草Maxim的干燥地上部分[1]，具有祛風濕、通經絡、止瀉痢等作用[2-3]。目前對老鸛草的研究多停留在化學成分的含量測定及指紋圖譜，這些研究[4-6]所獲得的HPLC圖譜不能反映出老鸛草的內在藥效。老鸛草有明顯的抗腫瘤作用，常用于乳腺癌、結腸癌和肺癌等腫瘤的治療。老鸛草中含有多種生物活性成分，可以抑制癌細胞的生長和分裂，同時通過促進免疫功能，抵御癌癥的侵襲，因此，老鸛草常被用于癌癥的輔助治療。本實驗根據老鸛草的功效，選擇其抗腫瘤作用作為藥效指標，對老鸛草有效部位的指紋圖譜和抗腫瘤作用的關系進行初步的探討，建立能反映老鸛草抗腫瘤藥效[7-9]的譜效關系方程，闡明其抗腫瘤作用的物質基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

藥材經通化師范學院醫藥學院于俊林教授鑒定為牻牛兒苗科老鸛草Maxim.的干燥地上部分，其來源信息見表1。

表1 30批老鸛草藥材產地信息

1.2 試劑

對照品老鸛草素（批號100503，上海融禾醫藥科技有限公司）、沒食子酸（批號110831-201906）、柯里拉京（批號111623-200302）、鞣花酸（批號111959-201903）、羥基喜樹堿（批號110832-201908）購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數均≥98%。人乳腺癌細胞株MCF-7由首都醫科大學中藥學院傳代保種。RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

WELLSCAN MK 3型酶標儀（美國Bio-Rad公司），Agilent1260高效液相色譜儀，KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）。

2 方法

2.1 老鸛草HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸對照品，置于4個50 mL量瓶中，分別用甲醇定容。制成分別含沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸232、120、50、150 μg/mL的單一對照品溶液。再精密量取沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸對照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成含沒食子酸23.2 μg/mL、柯里拉京12 μg/mL、老鸛草素5 μg/mL和鞣花酸15 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取老鸛草約1 g，精密稱定，粉碎，用18 mL 70%丙酮超聲提取60 min，濾過，濾液減壓濃縮得浸膏，減壓回收溫度均不超過40 ℃，濃縮液置10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，得供試品溶液，備用。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相見表2，體積流量為0.8 mL/min，檢測波長278 nm，進樣體積2 μL。

2.1.4 精密度試驗 取老鸛草樣品（S1）適量，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣6次，將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”，得到各圖譜的相似度均大于0.92，計算16個主要共有峰相對保留時間RSD＜2%，峰面積RSD＜2%，符合指紋圖譜的要求。

表2 流動相的梯度洗脫程序

2.1.5 穩定性試驗 取老鸛草樣品（S1）適量，按照“2.1.2”項方法制得供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h，按“2.1.3”項色譜條件進行測定，將所得數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”，得到各圖譜的相似度均大于0.93，計算16個主要共有峰相對保留時間RSD＜2%，峰面積RSD＜2%，符合指紋圖譜的要求。

2.1.6 重復性試驗 取老鸛草樣品（S1）適量，按照“2.1.2”項下方法平行制得6份供試品溶液，按“2.1.3”項色譜條件進行測定，將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”，得到各圖譜的相似度均大于0.91，計算16個主要共有峰相對保留時間RSD＜2%，峰面積RSD＜2%，符合指紋圖譜的要求。

2.1.7 老鸛草化學指紋圖譜的構建 精密吸取供試品溶液，分別注入液相色譜儀，按照“2.1.3”項色譜條件檢測。采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”進行模式識別，獲得了老鸛草指紋圖譜的共有模式[10]。以中國食品藥品檢定研究院提供的老鸛草對照藥材為參照圖譜，對照圖譜的生成方法為平均數法。

2.2 抗腫瘤活性的測定

2.2.1 樣品溶液制備 用蒸餾水懸浮分散浸膏后，依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取。分別稱取各樣品適量，用80 μL DMSO配成25 g/L的母液，再用RPMI-1640培養液分別稀釋成0.5、5、50、100、250、500 mg/L溶液，備用。陽性藥羥基喜樹堿用RPMI-1640培養液稀釋成0.01、0.1、l、10、100 mg/L溶液。

2.2.2 細胞培養 MCF-7細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2.3 MTT法測定各樣品的抗腫瘤活性 將對數生長期的細胞用胰酶消化后配制成濃度為1×104個/mL的細胞懸液，按1000個/孔接種于96孔板，每孔加100 μL。次日加入含不同濃度藥物及相應溶劑對照的新鮮培養基，每孔加100 μL（DMSO終濃度＜0.5%），每藥設4個劑量組，每組設6個平行孔，給藥后于37 ℃繼續培養72 h后，棄上清，每孔加100 μL新鮮配制的含0.5 mg/mL MTT的無血清培養基，繼續培養4 h，棄上清液，每孔加200 μL DMSO溶解MTT甲沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，用酶標儀在參考波長490 nm，檢測波長570 nm條件下測定吸光度（）值，以溶劑對照處理的腫瘤細胞為對照組，用公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率。并按中效方程計算半數抑制濃度（IC50）。

抑制率＝(對照組平均值－給藥組平均值)/對照組平均值

2.3 老鸛草抗腫瘤譜-效關系研究

2.3.1 建立老鸛草抗腫瘤譜-效關系方程 將HPLC法測定所得各峰面積均數化[11]，處理成量化共有峰數據。處理后的共有峰數據（）為各峰與各峰平均面積的比值（＝峰的面積值/峰平均面積值），以衡量樣品中各成分含量的變化情況。以量化共有峰數據為自變量，腫瘤細胞增殖抑制率為因變量，使用軟件SPSS 21.0，采用后退法建立譜效關系[12]方程。

2.3.2 建立老鸛草抗腫瘤譜-效關系驗證方程 為證明所列方程的合理性，將HPLC法測定各峰數據均數化峰面積，處理成量化共有峰數據，代入方程進行驗證[13]。

3 結果與分析

3.1 老鸛草HPLC指紋圖譜分析

3.1.1 相似度評價 將30個老鸛草樣品的AIA格式的數據文件導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統研究版（2004A）》軟件，以吉林通化藥材（S1）作為參照譜圖，多點校正生成對照圖譜（R），計算各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜的相似度，相似度在0.589～0.976，大部分樣品相似度較高，但是由于產地、生長環境和提取純化過程等原因，個別樣品與對照圖譜差異較大，不能直接建立老鸛草藥材指紋圖譜[14]的共有模式。運用主成分分析和聚類分析進一步分析樣品間差異，以便最終能夠建立合理的老鸛草藥材的標準指紋圖譜。

3.1.2 主成分分析（principal components analysis，PCA） 各老鸛草樣本經過上述實驗獲得各自的色譜數據，通過色譜工作站將圖譜進行積分后以保留時間和色譜峰面積作為數據的信息，以相對保留時間定位，以對應的峰面積的積分值作為數據源，形成30個樣本數據矩陣。對數據矩陣進行PCA投影。老鸛草數據PCA的平面投影圖見圖1，結合旋轉成份矩陣列表可知，30號樣品和前3種成分的相關度都很低，屬于第4種成分?？梢?0號樣品與其他樣品差距較大，進一步縮小了選擇范圍。

圖1 PCA平面投影圖

3.1.3 系統聚類分析 對30個樣品數據進行系統聚類分析，采用組內聯結法、夾角余弦作為測量的距離變量，聚類樹形圖見圖2，結合PCA分析結果，將距離較遠的30號樣品排除。

3.1.4 老鸛草藥材標準指紋圖譜的建立 將上述29批樣品的AIA數據文件導入軟件，對上述藥材進行相似度評價，設定S1為參照，多點校正，設定參照圖譜，將譜峰自動匹配，生成的疊加圖見圖3，得到的共有峰對照圖譜見圖4，結果29批老鸛草藥材具有16個共有峰。相似度計算結果見表3。相似度計算結果表明，29批樣品與對照圖譜比較，相似度均在0.732以上，說明不同來源老鸛草樣品化學成分差異較大，可為老鸛草藥材的品質評價提供科學依據。

圖2 老鸛草樣品聚類分析

圖3 29批老鸛草藥材提取物的HPLC疊加圖

1-沒食子酸 7-柯里拉京 8-老鸛草素 12-鞣花酸

表3 29批樣品相似度評價結果

3.1.5 老鸛草主要共有峰歸屬 經過相似度軟件分析出29個產地老鸛草藥材具有16個共有峰。保留時間依次為12.155、17.893、20.575、27.067、36.649、39.43、50.182、52.617、57.233、59.529、81.643、82.789、84.856、88.980、90.273、91.759 min。將各峰依次編號為1～16。通過對照品色譜圖指認，確定1號峰為沒食子酸，7號峰為柯里拉京，8號峰為老鸛草素，12號峰為鞣花酸。

3.2 抗腫瘤活性分析

3.2.1 老鸛草中各萃取部位的抗腫瘤活性 實驗結果顯示老鸛草的醋酸乙酯和正丁醇部位對腫瘤細胞都有一定的抑制作用，其中醋酸乙酯部位對MCF-7細胞的IC50為（12.47±3.86）μg/mL（表4），小于30 μg/mL。一般認為當植物粗提取物IC50≤30 μg/mL時，可初步認為有一定的抗腫瘤作用，值得進一步研究[15]。因此老鸛草70%丙酮提取物的醋酸乙酯部位活性相對最強，確定為老鸛草的抗腫瘤活性部位。

表4 老鸛草不同萃取部位對MCF-7細胞的IC50(, n = 3)

3.2.2 老鸛草醋酸乙酯部位抗腫瘤活性測定 29份老鸛草藥材的醋酸乙酯部位對腫瘤細胞MCF-7的抑制率見表5。

3.3 老鸛草抗腫瘤譜-效關系研究

3.3.1 量化共有峰數據 隨機選取23個樣品的量化共有峰數據結果見表6，將16個共有峰依次設為1、2、3……16。剩余6個樣品用于驗證的量化共有峰數據見表7。

表5 老鸛草提取物對MCF-7細胞的抑制率

表6 23個老鸛草樣品醋酸乙酯層的HPLC量化共有峰均數化數據

續表6

表7 6個驗證樣品的HPLC量化共有峰均數化數據

3.3.2 老鸛草抗乳腺癌譜-效方程 用后退法篩選出來的對抑制MCF-7細胞株生長有顯著貢獻的變量有8個，即1、2、5、10、12、13、14、15。老鸛草抗乳腺癌譜-效方程為＝0.234＋0.0471＋0.0522＋0.1025－0.03310＋0.09712－0.11213－0.08614＋0.15715

3.3.3 殘差圖 方程殘差服從近似正態分布，自變量和因變量之間呈線性關系，說明所用模型適合用于建立老鸛草醋酸乙酯提取物的抗乳腺癌譜-效關系方程，見圖5、6。

圖5 因變量馬氏距離分布直方圖

圖6 因變量正態概率圖

3.3.4 驗證方程 將6個驗證樣品的量化共有峰數據代入老鸛草抗乳腺癌譜-效方程，計算偏差率。

偏差率＝估計值/真實值－1

從表8可以看出，由所建立的數學模型計算得到的6批老鸛草驗證樣品的抑制率估計值與實驗測得真實值的偏差率全部在±10%以內。

4 討論

4.1 最佳提取工藝的考察

本實驗選用70%丙酮為溶劑對老鸛草中的成分進行提取。通過干酪素法對總鞣質含量進行測定，確定老鸛草的最佳提取工藝。選取料液比（A）、超聲時間（B）和超聲頻率（C）為主要考察因素，每個因素取3水平，正交試驗表安排試驗方案，分析結果表明，以總鞣質為考察指標時，各因素的影響大小均為A＞C＞B，即料液比影響最大，超聲時間影響最小。根據正交試驗確定的最佳提取條件為：液料比為1∶18的70%丙酮在100 kHz超聲頻率下超聲提取60 min。驗證實驗，重復3次，得到總鞣質質量分數為1.83%。結果表明確定的最佳提取工藝效率較高，切合實際。

表8 老鸛草抗乳腺癌譜-效相關質量評價數學模型驗證結果

4.2 色譜條件的考察

本實驗以采于黑龍江大慶的9號老鸛草樣本考察了Agilent XDB-C18色譜柱、Agilent Zorbax-C18色譜柱、Agilent Extend-C18色譜柱、迪馬C18色譜柱、大連依利特C18色譜柱和美國熱電C18等6種色譜柱的分離情況，色譜柱規格均為（250 mm×4.6 mm，5 μm），結果發現各色譜柱基本都能達到基線分離，但是各色譜柱峰位順序改變，因此選用其中一種分離情況最好、出峰最多的Agilent公司的XDB-C18作為實驗用色譜柱。本實驗分別用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-0.3%磷酸鹽為流動相，以不同梯度進行試驗，結果表明用甲醇-乙腈-0.3%磷酸鹽梯度洗脫效果最好；體積流量考察了0.8、1.0和1.2 mL/min，結果1.0、1.2 mL/min的體積流量分離效果不好，選用0.8 mL/min作為流動相的體積流量。

4.3 譜效關系

實驗在不同批次老鸛草提取物HPLC指紋圖譜共有峰與其抗腫瘤作用數據量化的基礎上，采用后退法對老鸛草指紋圖譜共有峰與抗腫瘤作用的大小進行相關性研究。結果顯示，采用體外活性篩選確定了老鸛草醋酸乙酯萃取部分對MCF-7細胞的生長抑制率最強，作為本實驗老鸛草抗腫瘤的活性部位。以29個老鸛草樣品為研究對象，開展高效液相色譜分析，所構建的老鸛草化學指紋圖譜，共有16個共有峰，分析指紋圖譜，可見各樣品的共有峰面積有差別。由所建立的數學模型計算得到的6批老鸛草驗證樣品的抑制率估計值與實驗測得真實值的偏差率均在±10%以內。本實驗建立了老鸛草抗乳腺癌譜效關系方程，體現了中藥藥效的產生是多成分相互協調、互補或制約的結果，為老鸛草藥材質量控制提供參考[16]。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Establishment of fingerprints and spectrum-effect relationship of anti-tumor activity offrom different places of origin

SUN Ren-shuang1, ZHAO Min-jing2

1. Changbai Mountain Key Laboratory for natural medicine, Medical College, Tonghua Normal Univetsity, Tonghua 134001, China 2. Meihekou Food and Drug Control, Meihekou 135000, China

To establish the HPLC fingerprint ofstudy the spectrum-effect relationship of anti-tumor activity ofand preliminarily clarify its main anti-tumor active components .The similarity evaluation software of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprints was used to establish the HPLC fingerprints of the anti-tumor active fractions ofMTT method was used to determine the anti-tumor activity of effective parts ofby using human breast cancer cell MCF-7 as a model. Multiple linear regression method was used to combine the quantitative characteristic peak area with the anti-tumor activity results ofmeasured by MTT method to construct the anti-tumor spectrum effect relationship ofThrough the establishment of fingerprint, 16 common peaks were picked, it is determined that peak 1 is gallic acid, peak 7 is corrilagin, peak 8 is geranium, and peak 12 is ellagic acid. The similarity of each sample was higher than 0.732. Further analyze the differences between samples using principal component analysis and cluster analysis, and exclude sample 30 that is farther away.The results showed that 8 of the 16 common peaks in the HPLC fingerprint had effects on MCF-7 cells, and the spectral efficiency equation for MCF-7 was obtained. After verification by six batches of medicinal materials, the deviation rate between the calculated value of the spectral efficiency equation and the actual value was not exceed 10%.The spectrum-effect equation can be used to predict the anti-breast cancer effect of.

Maxim.; fingerprint ; anti-tumor; spectrum-effect relationship; gallic acid; corilagin; geraniin; ellagic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2023)15 - 5003 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.025

2022-12-06

國家自然科學基金項目（81973431）；通化師范學院應用研究項目：中藥質量評價研究（01054）

孫仁爽，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為中藥藥效物質基礎和質量控制研究。E-mail: 804590217@qq.com

[責任編輯 時圣明]