代謝組學研究方法及其在骨質疏松中的應用探析

董 馨，李春燕，薛培鳳，陸景坤，王 智，王 辰，渠 弼

（內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010059）

骨質疏松是一種病因復雜的常見的進行性骨骼疾病。其特征為單位面積內骨組織量低于正常標準（T 值介于-1 g/cm3和1 g/cm3之間），易造成疼痛、骨折及駝背等，且患者結構以老年人和絕經后婦女為主。近年來，全球骨質疏松患病率的激增給社會帶來嚴重的經濟危害，骨質疏松現已成為嚴峻的公共衛生問題。對骨質疏松生物標志物的研究有助于做到對疾病的早發現和早預防，對降低患病率有重大意義[1，2]。

骨質疏松是一種代謝性疾病，代謝組學被廣泛用于骨質疏松的研究。代謝組學是繼蛋白質組學和基因組學后新發展的一門學科，與其他組學的研究思想有相近之處，可通過對生物體液或機體各組織中存在的各種代謝物的識別來探究機體內代謝物轉化的規律或機體在生理、病理刺激下的動態變化，為解釋骨質疏松生理或病理機制提供另一種新的視角，成為骨質疏松的預防、診斷和治療更簡捷的工具[3]。

1 代謝組學的研究方法

1.1 樣品采集和制備

1.1.1 樣本采集 在代謝組學研究中，樣本的選取和制備對代謝物的檢測結果有較大的影響，制備方案應盡可能覆蓋所有的代謝產物。骨質疏松代謝組學研究所選取的樣本有血液、尿液、糞便、膽汁及全身各組織[4]。血液參與全身循環，包含大量的代謝物，能整體地反映機體的生理病理狀態，通常作為代謝組學樣本的首選。由于全血中同時包含細胞外液和細胞內液，基質的復雜性增加，在實際檢測中多對血清和血漿進行分析[5]。糞便樣本通常用來分析機體與腸道菌群之間相關作用。尿液樣本中常含有藥物和工業產物，通常用來反映藥物代謝的最終狀態。尿液和糞便具有采樣便捷、可大量取樣等優點，但由于樣本濃度差異較大、代謝物種類與含量參差不齊，增加定量難度[6]。組織樣本的選擇具有明確的目標性，樣本含有豐富的代謝物信息，但制備方法較為復雜。總之，不同種類的研究需要選擇合適的樣本，以達到分析的準確性和無偏向性。

1.1.2 樣品制備方法 生物樣品組成復雜，基質干擾性強，為了提升待測樣品的分析準確性，在檢測前都需經過前處理，將待檢成分最大限度與基質分離。常見的樣本前處理方法包括：直接稀釋進樣法、溶劑沉淀法、離心超濾法及固相萃取法等。溶劑沉淀法被廣泛應用于血清、糞便、組織、細胞等樣本，成本低，可用于高通量篩選，但操作復雜、準確性低，操作過程中對樣品的稀釋易致成分缺失[7，8]。直接稀釋進樣法適用于尿液樣本，操作便捷，可降低溶劑對儀器分析的影響，減少被分析物的丟失。離心超濾法在處理各種生物樣本時，無需加入沉淀蛋白劑便可除去基質中大部分高分子有機物質，操作簡單、成本低廉，可保證檢測結果的靈敏度[9]。固相萃取法被譽為最具前景的樣本前處理方法，在處理生物樣本時能夠高效去蛋白，同時對樣本進行濃縮，提升靈敏度和樣本回收率，降低分析誤差[10]。

1.2 高通量質譜在樣品分析中的應用

其分析和檢測主要依賴于高通量的質譜（mass spectrograph，MS）。MS具有較高的靈敏度，數據掃描范圍廣、速度快，對于熱不穩定、易揮發、不易衍生化和相對分子質量較大的物質同樣適用。而且近年來質譜的數據庫和分析軟件也得到了快速發展，這些優點使得MS 在代謝組學研究中使用更為廣泛[11]。但是MS只能對化合物進行鑒定，實現高通量要先將成分進行高效分離，才能得到更好的分析效果。液相色譜質譜聯用系統（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）作為體內成分分析的理想工具，可以同時對樣品進行分離與檢測，實現樣品分析高效性[12，13]。

1.3 數據處理方法

代謝組學通過對生物體內代謝物的變化情況分析，可識別出數千個甚至更多的變量數據。將龐大的數據量進行空間模型擬合、理論計算、數據轉換等過程是數據處理的一大難點，通常需要選擇合理的數據處理方式。

1.3.1 主成分分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種通過降維的原理，把多變量的空間轉化為幾個主成分空間的重要統計方法之一，通過對整個數據進行分析和概覽，揭示出各組數據的趨勢和離群值并獲得各變量之間的相似性和差異性信息[14]。數據信息通常需要擬合成各種直觀的可視化圖形表達信息，PCA 通常運用主成分得分圖和主成分載荷圖表達各變量的相似性和差異性。

1.3.2 偏最小二乘判別分析 偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）是一種有效的統計方法，其原理與PCA 相似，將各個樣本分組分類，相較于PCA 更容易發現組間差異，尤其是對于樣本組間差異較小的分析更適合采用PLS-DA分析。

1.3.3 正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法。其最大的特點是可以去除變量X 中與變量Y 無關的數據變異，使分類信息主要集中在一個主成分中，從而使得模型相較于PLS-DA 更簡單，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[15]。OPLS-DA 可對兩個組別的樣本的數據進行解析和判別，可以很清楚地展現兩組間變量的差異性。而這種差異性是通過S圖直觀地展示出來，在S圖中，可以清楚地顯示出各變量的差異程度，距離原點越遠，表現差異性越高。這提示化合物更有可能成為生物標志物。

1.4 代謝組學數據處理平臺

生物機體的代謝過程復雜，涉及的代謝物眾多，且代謝組學運用到MS 和NMR 等高分辨率、高準確性的分析儀器，產生的數據量大，數據的處理過程復雜。近年隨著代謝組學和液相色譜質譜聯用的快速發展，相應的數據處理軟件及平臺也得到快速發展。目前被廣泛使用的實驗數據分析平臺有XCMS、Compound Discover 以及Simca-P 等，且每個平臺都有其獨有的特點[16，17]。

XCMS是一個相對簡便的代謝組學數據處理平臺，有非常直觀的圖形界面來提供對質譜數據的峰值檢測、保留時間矯正、峰對齊以及統計學分析等完整的工作流程。在數據處理完成后可以獲得保留時間校準前的總離子色譜圖、保留時間校正云圖、多維縮放和主成分分析等直觀的結果分析，接受大部分質譜數據格式，且識別的真實性較好，適合非靶標代謝組學的分析。

Compound Discover 是一款商用軟件，擁有著強大的數據處理分析能力。利用MS/MS 庫鑒定化合物，并用高分辨率的全質譜同位素和MS/MS 數據來測定元素組成。Compound Discover 還可以通過t檢驗、方差分析、主成分分析、PLS-DA、火山圖、盒型圖等進行統計和統計學分析，可以查看趨勢圖以顯示峰值區域，每個組的平均峰值面積。雖然其數據處理能力較為強大，但由于其商用的性質，限制了多數科研人員的使用。

Simca-P 也是一種多元化數據分析軟件，Simca-P提供了PCA、PLS-DA等模型的有效算法，可以方便的提取信息，在計算的同時給出了模型的各類統計量，提供了強大的輔助分析功能，保證了數據信息的有效性。Simca-P 通過簡單地操作就可對質譜以及平臺運算數據進行可視化處理，將其繪制成各種所需的圖形，且操作具有高度自由性，可編輯成各種類型圖表。

2 代謝組學在骨質疏松疾病機制研究中的應用

骨質疏松是以單位體積內骨組織量減少為特點的代謝性骨病。隨著代謝組學研究的深入，越來越多與骨質疏松疾病機制有關的代謝物被相繼發現，這些代謝物參與的生物學過程包括：能量代謝、脂質代謝、氨基酸代謝及微生物群代謝等。

2.1 能量代謝

相關研究顯示，骨質疏松可能與能量代謝紊亂有關。成骨細胞分泌的非羧基化骨鈣素能通過干預機體內的葡萄糖代謝進而影響能量代謝，而能量代謝也能通過下丘腦、交感神經調控骨生成和骨重塑。骨重塑過程中結晶磷酸鈣或原纖維膠原蛋白的降解需要大量的能量，當能量代謝受到影響時，骨重塑也將受到影響[18]。檸檬酸是三羧酸循環中的一個中間產物，參與ATP 合成。琥珀酸作為電子傳遞鏈的電子供體，是三羧酸循環中的另一個中間產物。通過代謝組學實驗測得骨質疏松大鼠模型血清的檸檬酸和琥珀酸水平均明顯降低，三羧酸循環受損。這說明能量代謝紊亂可干擾骨組織健康水平。

2.2 脂質代謝

肥胖是誘導多種慢性疾病的因素之一。研究發現，骨質疏松與肥胖也有著密切的關系。現代臨床研究顯示，肥胖通過干擾成骨作用、破骨作用及骨代謝來誘導骨質疏松。Ye等[19]研究發現，Omega-3和Omega-6 等多不飽和脂肪酸對預防骨質疏松有積極的作用，可以影響鈣平衡，改變細胞膜功能，減少炎癥細胞因子或調節過氧化物酶體增殖物激活的受體γ 來減慢骨骼吸收并促進成骨細胞生成。LysoPC（18∶1）是甘油磷脂代謝中甘油磷脂酰膽堿的上游成分之一。研究顯示，去勢骨質疏松大鼠模型中LysoPC（18∶1）水平顯著升高，說明脂質代謝紊亂會對正常骨代謝造成一定影響，從而干擾骨骼健康[20]。

2.3 氨基酸代謝

多種氨基酸，如精氨酸、賴氨酸和谷氨酸等，可以促進成骨細胞的生長和分化。氨基酸會影響骨密度（bone mineral density，BMD），促進骨骼健康[21]。丙氨酸在骨骼代謝中起著關鍵的作用，通過促進胰島素樣生長因子以及膠原蛋白和肌蛋白的合成來影響骨骼代謝。Yu 等[22]研究BMD 低的絕經后女性尿液發現丙氨酸含量顯著增加，推斷丙氨酸與骨質疏松有著密切的聯系。Qi等[23]發現谷氨酸受體在成骨細胞、骨細胞和破骨細胞中廣泛表達，且有證據顯示谷氨酸的信號可調控骨的形成和吸收。

2.4 微生物群代謝

生物機體與體內微生物群相互共生，微生物群可作用于腸道上皮細胞和固有層細胞，調控機體的生理狀態。研究表明[24]，馬尿酸被作為骨質疏松疾病的關鍵生物標志物，由腸道微生物將食物中的芳香化合物代謝為苯甲酸，隨后結合甘氨酸形成。代謝組學分析發現糖皮質激素誘導的骨質疏松大鼠模型體液中的馬尿酸水平顯著降低。這提示糖皮質激素可能干擾了腸道微生物群導致骨質疏松。

3 代謝組學技術在骨質疏松疾病診斷中的應用

骨質疏松是一種代謝性疾病。隨著疾病的發生，一些小分子代謝物的種類和數量也會隨之改變，這些改變可能早于臨床癥狀的出現。利用代謝組學技術監測骨質疏松相關生物標志物的動態水平，能夠實現早期診斷。Takeshi 等[25]通過對絕經后婦女進行研究發現，低骨量人群的尿素、肌酸以及多種氨基酸與正常人相比都有顯著的差異。Pontes等[26]通過對中國不同骨密度的女性進行代謝組學研究，最終確定了牛磺酸、乳酸以及多種氨基酸為骨質疏松的生物標記物。代謝組學從全局出發尋找與疾病相關的生物標志物，表征疾病所特有的代謝模式，樣品易獲取、技術高通量，在疾病早期診斷方面有很大的應用潛力。

4 展望

近年代謝組學憑借其高靈敏度、全面的特點逐漸興起，為骨質疏松的研究打開了新的思路，并發現了多個與骨質疏松相關的生物標志物及其代謝途經，這些發現為臨床上預防、診斷和治療骨質疏松提供了新的方法。高分辨率質譜與多檢測器聯用也被用于疾病診斷，高通量和高靈敏度使得疾病診斷效率得到有效地提升。

盡管代謝組學已是廣大科研人員認可的研究手段，但骨質疏松病因復雜，只從代謝維度研究整體致病機理具有片面性。近年興起的基因組、轉錄組和蛋白質組技術可結合代謝組學從多個層面獲得病理狀態或藥物治療后的生理變化。將這些變化富集和追溯到最集中的通路和靶點，通過對基因、RNA、蛋白質以及體內小分子等整體變化物質進行綜合分析，反映出組織器官功能和代謝狀態，更加深入地對骨質疏松進行研究，實現更精準的診斷和治療。但多組學整合技術尚未完全成熟，匹配臨床信息的多組學研究結合多樣本高通量分析仍是整合過程中的瓶頸，攻克多組學數據整合這道難題，并將之運用于骨質疏松的診斷和治療當中是相關科研工作者的共同目標。