基于網絡藥理學及分子對接探析“黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的作用機制※

王夢詩,郭 玲,何學紅

(1.遼寧中醫藥大學,遼寧 沈陽 116600;2.遼寧中醫藥大學附屬醫院,遼寧 沈陽 110000)

慢性腎衰竭(chronic renal failure,CRF)是因各類慢性腎臟病持續進展至后期,腎實質發生損害,出現水電解質及代謝產物紊亂、酸堿平衡失調等全身各系統癥狀的一種臨床綜合征。慢性腎臟病對人類健康有較大威脅,西醫對本病的治療以透析為主,但不良反應較為明顯,故在疾病發展早期應用中醫藥延緩疾病進程十分必要。

遼寧省名中醫何學紅教授師承全國老中醫藥專家學術經驗繼承工作指導老師郭恩綿,其認為CRF是由于脾腎受損,濕濁毒邪內蘊,使五臟虛損,氣血陰陽不足所致,針對本病臨床表現及病機提出補益脾腎、活血祛瘀利水的治法,沿用參芪泄濁飲分期而治,臨床療效顯著[1]。“黃芪-太子參-陳皮”為郭恩綿教授補脾常用藥對[2],符合張仲景《傷寒論》中對角藥的描述,3味藥物四氣五味相互融合,可增強療效[3]。本研究期望從網絡藥理學的角度闡釋參芪泄濁飲中健脾益氣的藥物“黃芪-太子參-陳皮”與CRF 間的關聯性,挖掘其通過何種途徑發揮治療作用,以期為后續臨床應用中醫藥治療CRF提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 “黃芪-太子參-陳皮”活性成分及靶點篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)檢索3味中藥的組成成分。設置口服生物利用度≥30%,類藥性≥0.18,根據藥物代謝動力學(ADME)參數篩選獲得藥物主要有效成分,并預測活性成分相關靶點,導入Uniprot數據庫,明確各蛋白匹配的基因名稱。

1.2 篩選CRF 靶點基因 以“慢性腎衰竭”“chronic renal failure”為關鍵詞,在 Genecards 數據庫、Drugbank數據庫、OMIM 數據庫收集CRF 靶點基因。由于Genecards數據庫結果過多,故以Relevance score＞中位數為基準,進行3 次篩選大于中位數的疾病靶點,最后合并3 個數據庫的靶點基因進行去重。

1.3 獲取藥物與疾病的共同靶點 將得到的“黃芪-太子參-陳皮”活性成分靶點基因和CRF 靶點基因輸入Bioinformatics平臺,得到兩者交集靶點,構建韋恩圖。

1.4 構建蛋白質相互作用(PPI)網絡 將1.3獲取的交集靶點基因提交STRING 11.0數據庫,設置物種類別為“Homo sapiens”,構建PPI網絡模型。

1.5 GO、KEGG 通路富集分析 應用Metascape分析平臺對交集靶點進行京都基因組與基因組百科全書(KEGG)富集分析和基因本體(GO)分析,計算P-value值,對目的基因進行排序,得到信號通路、生物過程(BP)、細胞組成(CC)及分子功能(MF)等信息。篩選前20 個結果,在Bioinformatics網站制作氣泡圖。

1.6 構建“藥物活性成分-疾病靶點-通路”網絡 輸入篩選完成的交集靶點的成分、靶點及KEGG 富集通路,在Cytoscape 3.8.2 構建“藥物活性成分-靶點-通路”網絡圖。根據網絡拓撲學參數分析各節點Degree值、介度及緊密度,得出發揮主要藥效的成分。

1.7 分子對接驗證 通過TCMSP數據庫檢索1.6中得到的核心成分化學結構,自PDB蛋白質數據庫下載核心靶點蛋白的3D 結構。在Py Mol軟件對蛋白結構去水及殘基處理,導入AutoDock Tools 加氫。在AutoDock Vina中對核心成分和靶點分別進行對接,選取最優結合能構象與靶點蛋白對接,結果導入Python-Pymol 2.2.0。

2 結果

2.1 藥物活性成分及靶點篩選 在TCMSP 數據庫初步收集黃芪活性成分87 種,太子參75 種,陳皮5種,根據ADME 值及相關文獻再次篩選后,最終得到黃芪活性成分17種,太子參6種,陳皮5種,見表1(黃芪節選前10位活性成分)。篩選出的黃芪活性成分靶點379個,太子參108個,陳皮79個,去除三者重復值,最終保留角藥活性成分靶點共232個。

表1 “黃芪-太子參-陳皮”角藥活性成分(黃芪選取排名前10位成分)

2.2 藥物與疾病交集靶點的獲取 自Genecard數據庫共收集疾病靶點基因4 597個,3次篩選Relevance score＞中位數的基因,獲得CRF 靶點基因575個,合并Drugbank、OMIM 數據庫并去重,最終保留1 145個靶點基因。輸入Bioinformatics平臺,共獲得藥物活性成分與疾病交集靶點75個,見圖1。

圖1 “黃芪-太子參-陳皮”角藥-慢性腎衰竭疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物治療CRF的PPI網絡的構建 在STRING平臺輸入2.2 中得到的交集靶點,繪制PPI網絡,見圖2。應用Cytoscape 3.8.2 繪制更為清晰的PPI網絡,見圖3。此網絡包含73個節點和1 335條連線,節點面積大,顏色深,則越重要。根據Degree值由高到低排序,前5 位為IL6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53,分別是64、64、63、61、60,這些靶點則預測為“黃芪-太子參-陳皮”治療CRF的關鍵靶點。

圖2 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的靶點蛋白質相互作用圖

圖3 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的靶點高級蛋白質相互作用圖

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用Metascape進行富集分析,分別得到169 條KEGG 富集通路,細胞組分(CC)51個條目,分子功能(MF)99個條目,生物過程(BP)1 427個條目,參考Metascape平臺分析結果,均取前20 個,在Bioinformatics 繪制KEGG、GO 氣泡圖。圖左側為富集名稱,氣泡大小與該通路的基因計數呈正相關,橫軸為輸入基因占該通路基因的比值。KEGG 富集分析結果包含HIF-1 信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路等。GO 功能分析結果中,CC主要有膜筏、囊腔、細胞溶脂等,MF 主要有酶結合、蛋白質同型二聚體活性等,BP主要有凋亡信號通路、對脂多糖的反應等。見圖4。

圖4 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的京都基因組與基因組百科全書(KEGG)富集分析及基因本體(GO)分析

2.5 構建“藥物活性成分-疾病靶點-信號通路”網絡圖 將“黃芪-太子參-陳皮”藥物活性成分、交集靶點、KEGG 富集通路,傳至Cytoscape繪制網絡圖,見圖5。結果反映藥物治療CRF 呈多成分、多靶點、多通路的機制。通過Network Analyzer內置插件對結果進行拓撲學分析,最終預測得出活性核心成分、核心靶點。活性核心成分是槲皮素、木犀草素、山柰酚,Degree值為61、28、22,核心靶點是PTGS2、RELA、AKT1,Degree值為23、18、16。

圖5 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的活性成分-靶點-信號通路網絡

2.6 分子對接驗證 將2.5中得到的核心活性成分及核心靶點分別進行分子對接,結果見表2。Autodock軟件普遍認為,配受體的結合能≤-5.0 kcal·mol-1表示兩者的結合活性較好,若≤-7.0 kcal·mol-1則其結合活性較強[4]。從表2可見,各核心活性成分及核心靶點間結合能力均較好,其中槲皮素與PTGS2、木犀草素與AKT1、山柰酚與RELA 之間具有最強結合力。在Python-Pymol 2.2.0中導入最優對接結果,見圖6。

圖6 核心基因與“黃芪-太子參-陳皮”角藥核心靶點最優值分子對接模型圖

表2 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的核心活性成分與核心靶點分子對接結果

3 討論

中醫并無關于慢性腎衰竭病名的直接記載,但據其臨床表現,可歸于“癃閉”“關格”“腰痛”“虛勞”等范疇[5]。何學紅教授認為,CRF 患者總屬先天稟賦不足,脾腎虛損,濁瘀膠著,阻滯脈絡,最終發展為五臟皆虛。數據顯示,遼寧地區CRF 患者中,脾腎兩虛證者為首位[6]。CRF臨床表現為水腫、少尿、腰酸痛、面少華、食少納呆、舌胖大、有齒痕等脾腎虛證之象。李中梓言:“脾具土德,脾安則土為金母,金實水源,且土不侮水,水安其位,故脾安則腎愈安也。”由此可見,腎臟病病機與脾腎相關。關于本病的病因病機,中醫古籍多有記載。《素問·至真要大論》言“諸濕腫滿,皆屬于脾”,脾虛則津液運化失司,水液代謝紊亂,發為水腫。脾虛清氣不升、濁氣不降,腎虛開闔失固,脾腎兩虛,久病致瘀,精微物質失澀外泄,表現為尿有泡沫,稱為蛋白尿。CRF患者也可見面色萎黃、貧血之象,《靈樞·決氣》言“中焦受氣取汁,變化而赤”,脾胃為氣血生化之源,CRF 患者多體弱病久,脾虛失于統血,血行滯,溢脈外,表現為面少華、舌紫暗有瘀斑等癥狀。周身乏力為CRF常見癥狀之一,可能為低鉀血癥或貧血等。中醫理論認為,人體肌肉壯實與否,與脾胃運化相關,脾旺則血足,身體強壯,反之則四肢無力,甚或大肉盡脫。《四圣心源》言:“肌肉者,脾土之所生也,脾氣盛則肌肉豐滿而充實。”“脾主肌肉”,“治痿獨取陽明”,腎脾為先后天之本,脾之健運依賴于腎陽溫煦,腎藏精又依靠脾精滋養,脾腎虧虛,則臟腑失養,肌肉萎縮。綜上,何學紅教授在CRF的治療早期從健脾益氣補腎的基本治法入手,應用參芪泄濁飲治療,以黃芪、太子參為君藥,配伍陳皮等理氣之藥,脾腎共治,以達補后天以養先天之效。黃芪補脾益氣、利水消腫。研究顯示,黃芪可提高血漿白蛋白水平,促進水鈉排泄,改善腎臟微循環[7]。太子參是中醫臨床常用補虛藥,具有益氣健脾、生津潤肺之效,可治療脾虛體倦、氣陰不足等。兩藥相輔相成,補益肺、脾、腎氣機,升清降濁,行血利水。陳皮味苦,辛散溫通,行理氣化痰和中之功,能有效緩解CRF患者脾胃氣滯、嘔惡納呆等胃腸道不適反應[8]。三藥相合,共奏益腎健脾之功。

本研究結果顯示,“黃芪-太子參-陳皮”角藥治療CRF的活性核心成分可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚,核心靶點為PTGS2、RELA、AKT1。CRF 的疾病進展與腎間質纖維化密切相關,槲皮素可抑制α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達,減少系膜細胞增殖,并抑制細胞外基質的分泌[9]。國內外研究表明,槲皮素具有抗氧化、降低過氧化脂質的作用[10],可通過影響腎小球細胞間黏附分子E-鈣粘素的表達,從而保護腎臟細胞免受損傷[11]。實驗研究結果證實,槲皮素可增加腎衰竭大鼠腎組織中一氧化氮含量,對腎臟微循環和組織細胞起保護作用[12]。糖尿病腎病及高血壓腎病是罹患CRF的重要病因[13],木犀草素可通過抗氧化作用降低腎皮質轉化生長因子β1、纖溶酶原激活物抑制物-1的表達,對腎臟起保護作用。山柰酚可降低腎組織中白介素細胞(IL)-1β、IL-6等炎癥因子水平,減緩脂多糖誘發的急性腎功能損害發生[14]。研究表明,山柰酚能抑制高糖誘發的腎系膜細胞增殖,保護腎臟功能,延緩纖維化發展[15]。PTGS2 又稱環氧化酶2(COX-2),研究顯示COX-2與腎小球硬化及腎功能惡化相關,在腎血流動力學和電解質穩態中起至關重要的作用,抑制COX-2的過度表達是防治CRF 的有效途徑之一[16]。AKT1在人體各組織中普遍表達,是參與細胞增殖、代謝的關鍵調節因子,在細胞內的表達對改善腎臟間質纖維化有重要意義[17]。RELA 又名轉錄因子p65,是構成核因子κB(NF-κB)異二聚體的快反應轉錄因子之一,參與調節細胞生長分化、免疫、氧化應激等[18],調控氧化低密度脂蛋白誘導的腎小球系膜細胞異常脂代謝,降低腎小球硬化過程的發生率[19]。KEGG 通路富集分析顯示,角藥治療CRF 與HIF-1通路有關。HIF-1稱低氧誘導因子,在炎性反應中具有重要作用,HIF-1α過度表達會導致促炎細胞因子生成增加,激活腎臟炎性反應和纖維化機制[20]。分子對接結果顯示,活性核心成分槲皮素、木犀草素、山柰酚分別與PTGS2、AKT1、RELA結合具有穩定性。

綜上所述,本研究立足于名老中醫治療CRF的用藥規律及治法經驗總結,通過網絡藥理學探究參芪泄濁飲中健脾益氣角藥“黃芪-太子參-陳皮”作用于CRF的分子機制,預測得到活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚,可能作用于PTGS2、AKT1、RELA 等多個靶點,通過HIF-1等信號通路,延緩腎間質纖維化。角藥各有效成分均可通過調控多種信號通路干預CRF的進展,但由于中藥包含的化學成分十分復雜,中藥組方配伍具有多變性,藥物作用及體內代謝的多方式、多途徑,各類中藥、疾病信息庫的同質性,成分篩選指標的局限性及眾多信息通路網絡,使分析結果具有不確定性。在證明中醫藥通過多途徑、多靶點、多通路治療疾病的基礎上,后續可反向分析角藥中含量較多的多糖、皂苷等如何作用于各類信號通路,其中的調控分子如何相互激活或抑制,為角藥發揮補脾益氣的作用機制進行補充。同時后續研究還可結合動物實驗對其驗證補充,探析中藥復方各類成分劑量對疾病治療的影響。