鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素在肉雞體內的藥代動力學和組織殘留量測定

金慶日, 黃小毛, 魏霞麗,PONGTANALERT Piyapong, 楊占英, 張君啟

(1.杭州醫學院,浙江 臨安 311399;2.浦城正大生化有限公司,浙江 浦城 353400)

金霉素(Chlortetracycline,CTC)是一種具有廣譜抗菌活性的四環素,用于治療立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體等細菌的感染[1-2]。CTC廣泛應用于動物產品體系中的疾病治療和預防,曾被用作預混料,提高肉雞[3]、豬[4]和奶牛[5]等動物的生產性能。CTC目前作為治療藥物和預防藥物,主要以混飲方式給藥[6]。然而,作為BSC(Biopharmaceutics classification system) IV類藥物,金霉素具有溶解度和滲透性低的特性[7-8]。因此,提高CTC的溶解度,將有利于提高其生物利用度和在農場中的應用[9]。研究表明,通過制備其鹽型[7,10]或噴霧干燥[9]制備的金霉素固體分散體可顯著提高其溶解度。改變藥物的體內行為(如灌服生物利用度、靶向性、透皮/透黏膜/跨血腦屏障特性等),最終可提高藥物療效,減少藥物不良反應并提高服藥依從性[11-14]。此外,金霉素在不同地區肉雞中的藥代動力學試驗結果并不一致[3,15],有必要對金霉素進行進一步研究。該試驗的目的是探究鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素在肉雞體內的藥代動力學特征以及連續給藥后的殘留試驗,以便為金霉素和超級鹽酸金霉素的臨床合理應用和給藥劑量的設定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸金霉素原粉和超級鹽酸金霉素由福建浦城正大生化有限公司提供。鹽酸金霉素標準品購自中國食品藥品檢驗研究院。其他溶劑和試劑均為分析級。

1.2 實驗動物

體重相似的健康300日齡黃羽肉雞40只,用于單次給藥的藥代動力學試驗和多次給藥后的殘留試驗。實驗動物飼養于溫度和濕度恒定的動物房中,動物室保持12 h的暗/光周期并提供飼料和水。肉雞在給藥前禁食12 h,允許自由飲水。

1.3 給藥和采血方案

將16只健康肉雞隨機分為鹽酸金霉素組和超級鹽酸金霉素組,每組8只。給藥前禁食12 h以上。給每只雞灌服鹽酸金霉素原粉和超級鹽酸金霉素溶液,給藥劑量為20 mg/kg。分別在給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10和24 h,通過翅靜脈采集血樣,每次采集1 mL。將采集好的全血置于肝素鈉離心管中,以8 000 r/min離心3 min,收集血漿并保存于-80 ℃冰箱,直至UPLC-MS/MS分析。

其余24只也被隨機分為鹽酸金霉素組和超級鹽酸金霉素組,以20 mg/kg劑量連續灌服7 d。第8天,用二氧化碳施行安樂死,收集腎臟、肝臟和肌肉組織樣品,保存于-80 ℃冰箱,直至UPLC-MS/MS分析。

1.4 分析方法

1.4.1 血漿樣品和組織樣品的預處理

取100 μL雞血漿樣品,置于1.5 mL離心管中,加400 μL三氯乙酸(1 mol/L),渦旋振蕩10 min,13 000 r/min離心10 min,吸取上清液。取300 μL上清液,置于樣品瓶中,用UPLC-MS/MS測定血漿中金霉素濃度。

取雞的肝臟或腎臟或肌肉組織樣品5 g,加入3倍體積的生理鹽水,用組織搗碎儀搗碎3 min。用0.45 μm針式過濾器過濾后,作為組織樣品液。取100 μL組織樣品液,置于1.5 mL離心管中,加400 μL三氯乙酸(1 mol/L),渦旋振蕩10 min,13 000 r/min離心10 min,吸取300 μL上清液,置于樣品瓶中,用UPLC-MS/MS測定組織中金霉素濃度。

1.4.2 液質聯用儀的檢測條件

色譜柱為 Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 Column (2.1×100 mm, 1.7 μm)和CortecsUPLCT3(2.1×100 mm, 1.6 μm),使用電噴霧電離(ESI)模式。在負ESI模式下進行分析。流動相為0.1%甲酸(A)和乙腈(B)。梯度洗脫條件為:0～2 min為90%A和10% B,2～4 min為70%A和30% B,4～6 min為5%A和95% B,6～7 min為90%A和10% B。流速0.3 mL/min,進樣體積10 μL,分析時間10 min。金霉素的去簇電壓30 V;金霉素的碰撞電壓20 V。金霉素的母離子和子離子的質荷比(m/z)分別為 478.8和444.1。

1.4.3 藥動學參數的計算

首先通過標準曲線和血漿樣品的峰面積計算血漿樣品中金霉素的濃度。采用WinNonlin軟件的非房室模型,計算各種藥動學參數,如生物半衰期(t1/2)、峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、濃度-時間曲線下面積(AUCall)、血漿清除率(CL),表觀分布體積(VZ)和平均滯留時間(MRTlast)等。

1.5 數據分析

采用SPSS軟件進行分析,組間差異用t檢驗。P<0.05視為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 金霉素血漿樣品的色譜圖

圖1為血漿樣品的色譜圖。

A:空白血漿色譜圖;B:標準溶液色譜圖;C:血漿樣品色譜圖;D:肝臟樣品色譜圖

圖1A為肉雞空白血漿色譜圖;圖1B為金霉素標準溶液色譜圖;圖1C 為肉雞灌服超級鹽酸金霉素后6 h血漿樣品的色譜圖;圖1D為肉雞連續灌服7 d超級鹽酸金霉素后采集的肝臟樣品的色譜圖。由圖1可知,血漿樣品中金霉素的保留時間為2.79 min,在組織樣品中的保留時間為5.76 min。血漿樣品和組織樣品中的保留時間不同,與使用不同的色譜柱有關。

2.2 肉雞灌服給藥鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素后的血藥濃度

單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素后血漿藥物濃度和藥時曲線如表1和圖2所示。試驗結果表明,單劑量(20 mg/kg)灌服超級鹽酸金霉素后的血漿藥物濃度顯著高于鹽酸金霉素。

表1 單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素后血藥濃度

圖2 單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素后的藥時曲線(Mean±SE, n=8)

2.3 藥動學參數的計算

用WinNonlin軟件的非房室模型,計算各種藥動學參數。單劑量(20 mg/kg)灌服給藥后,鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素的藥代動力學參數如表2所示。其中,AUCall為t0到t10 h的藥時曲線下面積,AUCExtrap為根據AUClast外推得到的藥時曲線下面積,MRTlast為平均滯留時間。

表2 單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素后的藥代動力學參數(n=8)

單劑量(20 mg/kg)灌服超級鹽酸金霉素后峰濃度為(4.69±0.54) μg/mL,顯著高于鹽酸金霉素(1.91±0.33) μg/mL(圖2,表2)。表明超級鹽酸金霉素的吸收速度快于鹽酸金霉素原粉,可快速發揮藥效。超級鹽酸金霉素單劑量(20 mg/kg)灌服給藥后AUCall為(14.51±1.20) hr·μg·mL-1,顯著高于鹽酸金霉素的AUCall(6.28±0.95) hr·μg·mL-1(圖2,表2),表明超級鹽酸金霉素到達全身血液循環的量也顯著高于鹽酸金霉素,有利于藥物迅速到達病灶發揮藥效。

2.4 殘留試驗

連續灌服(20 mg/kg)鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素7 d后,組織樣品中鹽酸金霉素的殘留量測定結果如表3所示。最后1次給藥后24 h,檢測肌肉和肝臟中鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素的殘留量接近或低于檢測限(組織殘留量低于10 μg/kg),遠低于食用動物肌肉中鹽酸金霉素的殘留限量(肌肉殘留限量為100 μg/kg,肝臟中的殘留限量為300 μg/kg),腎組織中鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素的殘留量分別為(306±58) μg/kg和(857±255) μg/kg。鹽酸金霉素低于超級鹽酸金霉素在食用動物肌肉中的殘留限量(600 μg/kg),超級鹽酸金霉素接近殘留限量(表3)。

表3 連續給藥7 d后鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素在組織中的殘留量

3 討論與結論

四環素類抗生素在許多國家普遍應用于人類、家畜和家禽[16]。在該試驗中,單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素肉雞的藥代動力學參數如表2所示。從藥時曲線(圖2)和血藥濃度(表1)可知,鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素均表現出雙峰現象,表明大多數藥物通過膽汁排入腸道,再重新吸收,具有明顯的肝腸循環現象,與文獻報道一致。

雖然超級鹽酸金霉素和鹽酸金霉素的Tmax無顯著性差異,但是單劑量(20 mg/kg)灌服超級鹽酸金霉素肉雞的Cmax為(4.69±0.54) μg/mL,鹽酸金霉素的Cmax為(1.91±0.33) μg/mL。此外,超級鹽酸金霉素的血漿清除率(CL)低于鹽酸金霉素的清除率[(1 362±110) mL·hr-1·kg-1vs (3 277±429) mL·hr-1·kg-1]。由此可見,超級鹽酸金霉素可在肉雞體內滯留較長時間,有利于長期發揮其藥效。造成此差異的原因可能是相比鹽酸金霉素,超級鹽酸金霉素的溶解度更高,也有可能是超級鹽酸金霉素的滲透速率快于鹽酸金霉素。

單次灌服(20 mg/kg)超級鹽酸金霉素后,血藥濃度-時間曲線下面積(AUCall)顯著高于鹽酸金霉素[(14.51±1.20) hr·μg·mL-1vs (6.28±0.95) hr·μg·mL-1](圖2)。表明超級鹽酸金霉素在肉雞血液循環中的量顯著高于鹽酸金霉素,肉雞的吸收速率和吸收程度也顯著高于鹽酸金霉素。這可能與其溶解度和滲透性增加有關,導致其在胃腸道的吸收加快。超級鹽酸金霉素的表觀分布容積(VZ)小于鹽酸金霉素[(4 125±378) mL/kg vs (11 197±2 592) mL/kg](表2)。表明超級鹽酸金霉素在血漿中的濃度高于組織中的濃度。而鹽酸金霉素的表觀分布容積為10～20 L/kg,表明藥物主要分布在細胞外液中。單劑量(20 mg/kg)灌服超級鹽酸金霉素后的平均滯留時間(MRTlast)與鹽酸金霉素類似。

此外,超級鹽酸金霉素的溶解度顯著高于鹽酸金霉素。在灌服藥物配制過程中,經過5 min的超聲和2次渦旋混合后,鹽酸金霉素仍有一些不溶性沉淀物,需要多次震蕩混勻和超聲才能完全溶解,而超級鹽酸金霉素的溶解性較好。

據報道,鹽酸金霉素的停藥時間為2.84 d[17],腎臟的殘留量應小于95%,因此在實際應用中應適當延長停藥期[18]。超級鹽酸金霉素具有更小、更規則的球形,增加了比表面積和與介質的接觸面積,從而提高了金霉素的溶解度和溶出速率。與晶態相比,非晶態的高內能和比表面積可加快溶出速率,提高生物利用度[19]。

由于超級鹽酸金霉素具有較快的吸收速度和較大的吸收程度,呈現為較高的血藥濃度和生物利用度,表明超級鹽酸金霉素在臨床治療中可替代鹽酸金霉素。這項研究是臨床試驗的基礎,也為臨床更謹慎地使用鹽酸金霉素提供了依據。給藥劑量應為20 mg/kg,連續7 d混飲給藥,治療后需設定合理的停藥期,以確保動物性食品的安全。