響應面優化超聲輔助提取青椒葉多酚工藝及抗氧化研究

藍 志 福

(漳州職業技術學院 繼續教育學院,福建 漳州 363000)

青椒(CapsicumannuumL.)也稱為燈籠椒或柿子椒,為茄科辣椒屬草本植物,起源于中南美洲的熱帶地區,現在已經在全國各地廣泛種植[1-2]。青椒的根、莖、葉、果實中含有多種天然有效成分,包括黃酮、多酚和生物堿等,這些成分具有多種生物生理功能[3-4]。其中,多酚是一種廣泛存在于植物果實、皮、葉、根和莖等部位中,含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素的復雜次生代謝物。多酚具有抗癌、抗病毒、抗氧化、改善人體免疫力、防止動脈硬化、降低血脂血糖等多種生理功能,廣泛應用于食品、化工、農業和醫藥等領域[5-6]。然而,目前尚未有青椒葉多酚提取的相關報道。隨著科技的不斷發展,超聲波輔助技術在植物提取方面的優勢越來越顯著。利用超聲波產生的高加速度、猛烈振動、劇烈的空化作用、熱效應以及攪拌作用等能夠使植物有效成分更易進入溶劑,具有省時、節能、高效和操作簡單的特點[7-8]。該研究以青椒葉為原料,以多酚提取率為指標,利用超聲輔助法對青椒葉多酚進行提取,并使用響應面對提取工藝進行優化,同時,評價青椒葉多酚的抗氧化活性。該研究為青椒葉多酚資源的深入研究及青椒葉抗氧化劑的開發利用提供了參考和指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

青椒葉采自福建省漳州市詔安縣西潭鎮,乙醇為食品級,產自河南漢永酒精有限公司。沒食子酸,分析純,購自無錫市亞泰聯合化工有限公司;硫酸鋰、鉬酸鈉、鎢酸鈉等均為市售分析純試劑。

超聲波清洗機(KQ250DE),購自昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見分光光度計(UV-1800PC-DS2),購自上海美譜達儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的測定

采用福林酚法[9]在可見光區的765 nm處測定青椒葉多酚溶液的吸光度,并利用吸光度與濃度之間的關系繪制標準曲線并回歸得到回歸方程。通過回歸方程,計算出試驗中青椒葉多酚的提取率。

(1)

式中,b為多酚質量濃度,mg/mL,V為定容后提取液體積,mL,m為青椒葉質量,g。

1.2.2 青椒葉多酚的提取工藝

采摘新鮮的青椒葉,用清水洗凈,再用蒸餾水淋洗,晾干。將晾干后的青椒葉在50 ℃烘箱中烤干,再使用粉碎機對其進行粉碎和過篩,備用。將1 g青椒葉粉末放入燒瓶中,并按照預設的工藝條件,置于超聲波清洗機中進行提取。待提取結束后,通過過濾、濃縮和定容等步驟處理樣品,得到青椒葉多酚提取液。根據式(1)計算出青椒葉多酚的提取率,并進行3次平行重復試驗,取平均值作為最終結果。

1.2.3 單因素試驗

該試驗將乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度作為考察因素,研究各工藝對青椒葉多酚提取率的影響。具體工藝如下:設定超聲時間40 min、液料比25∶1 (mL∶g)和超聲溫度70 ℃,改變乙醇濃度(分別選取50%、60%、70%、80%和90%)來考察;設定乙醇濃度70%、液料比25∶1 (mL∶g)和超聲溫度70 ℃,改變超聲時間(分別選取20、30、40、50、60 min)來考察;設定乙醇濃度70%、超聲時間40 min和超聲溫度70 ℃,改變液料比(分別選取15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 (mL∶g)來考察;設定乙醇濃度70%、超聲時間40 min和液料比25∶1 (mL∶g),通過改變超聲時間(65、70、75、80、85 ℃)來考察。

1.2.4 響應面試驗設計

為了探究乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度等4個單因素對青椒葉多酚提取的影響,該研究采用Box-Behnken實驗設計方法,在Design-Expert 8.05b軟件中建立4因素3水平的試驗方案(表1)。

表1 Box-Behnken因素和水平表

1.2.5 抗氧化性能測試

1) DPPH自由基清除率的測定

取2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液加入2 mL蒸餾水,混合均勻后測定其在517 nm處的吸光度,記為A0;取2 mL不同濃度的青椒葉多酚溶液,分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,混合均勻30 min,在517 nm處測定吸光度,記為Ai;取2 mL不同濃度的青椒葉多酚溶液,加入2 mL乙醇,混合均勻后測定517 nm處的吸光度,記為Aj。以抗壞血酸為對照,計算對DPPH自由基的清除率。

2) OH自由基清除率的測定

取2 mL不同濃度的青椒葉多酚溶液,分別加入2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL的9 mmol/L FeSO4溶液,繼續加入1 mL 0.01% H2O2溶液混合均勻后反應60 min,定容,并測得在510 nm處的吸光度,記為Ai。以蒸餾水代替H2O2溶液為對照組,測得吸光度,記為Aj,以蒸餾水代替青椒葉多酚為空白組,測得吸光度記為A0,計算對OH自由基的清除率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度的影響

由圖1可知,青椒葉多酚的提取率隨著乙醇濃度的增加而逐漸增加,并在乙醇濃度為70%時達到峰值。這是因為隨著乙醇濃度的上升,溶劑極性降低,導致其更容易破壞植物體內的氫鍵結構,使得多酚類物質更容易溶解出來。但當乙醇濃度過高時,乙醇會溶解其他一些醇溶性雜質,并與多酚類物質競爭乙醇中的溶解位點,從而降低多酚的提取率[10]。因此,選擇乙醇濃度為70%。

圖1 乙醇濃度對多酚提取率的影響

2.1.2 超聲時間的影響

由圖2可知,青椒葉多酚的提取率隨著超聲時間的延長而逐漸增加,并在超聲時間為40 min時達到峰值。這是因為隨著超聲時間的延長,震蕩和剪切作用使植物顆粒內部的多酚類物質逐漸釋放。但當超聲時間達到40 min時,多酚的提取率反而下降,這是由于大部分多酚類物質已經被釋放出來,進一步延長超聲時間會促進多酚類物質氧化分解,損失提取效率[11]。因此,選擇超聲時間為40 min。

圖2 超聲時間對多酚提取率的影響

2.1.3 液料比的影響

由圖3可知,青椒葉多酚提取率隨著液料比的增加而逐漸增加,并在液料比為25∶1(mL∶g)時達到峰值。這是因為液料比的增加將加大溶劑對青椒葉顆粒中多酚類物質的浸泡程度,從而增加了多酚與溶劑之間的濃度差。但當液料比過大時,雖然多酚類物質更易溶于大量的溶劑中,但在后續的濃縮過程中會造成大量的多酚類物質流失和損失[12-13],從而降低提取效率。因此,選擇液料比為25∶1(mL∶g)。

圖3 液料比對多酚提取率的影響

2.1.4 超聲溫度的影響

由圖4可知,青椒葉多酚提取率隨著超聲溫度的升高而逐漸增加,并在超聲溫度為70 ℃時達到峰值。這是因為提取體系溫度的升高會加速分子的熱運動,有效促進青椒葉顆粒中多酚類物質向溶液中的傳質和擴散,從而提高了多酚的溶解度和提取效率。但當超聲溫度過高時,部分多酚類物質會發生氧化反應,破壞其結構和活性,降低了提取率[14]。因此,選擇超聲溫度為75 ℃。

圖4 超聲溫度對多酚提取率的影響

2.2 響應面優化結果

2.2.1 響應面設計方案及分析

該研究采用Box-Benhnken試驗設計方法,進行青椒葉多酚提取率的研究。共進行了29組試驗,得到其多酚提取率數據見表2。隨后,利用Design Expert 8.05b軟件對這29組數據進行響應面分析,得到方差分析結果如表3所示。

表2 Box-Behnken試驗設計

表3 方差分析

對表2中的試驗數據進行分析,得到適合該研究的青椒葉多酚提取率(Y)作為響應值,以及乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、液料比(C)和超聲溫度(D)4個因素作為自變量的四元二次回歸模型:

Y=67.57+1.25A+0.47B-0.37C+2.19D+0.61AB+1.26AC+0.05AD+2.02BC+4.05BD-0.45CD-7.07A2-8.65B2-7.98C2-11.63D2.

根據表3的方差分析結果,該四元二次回歸模型具有極顯著的水平,表明該模型能夠準確地預測不同處理條件下的多酚提取率。同時,相關系數R2為0.906 7,說明該模型的預測值與實驗值之間具有高度的相關性,約90.67%的試驗數據能夠被該模型成功解釋和預測。此外,失擬項F=5.28,P=0.061 4>0.05,說明該模型中隨機誤差較小,即響應面模型能夠很好地擬合試驗數據。通過F及P值得出影響不顯著的因素為一次項A、B、C和交互項AB、AC、AD、BC、CD;影響顯著為超聲溫度的一次項D和超聲時間和超聲溫度的交互項BD;影響極顯著為二次項A2、B2、C2、D2,說明青椒葉多酚提取率受多個工藝因素的非線性影響,需要考慮相互作用。超聲溫度對多酚提取率的影響最大,其次是乙醇濃度、液料比和超聲時間。因此,在優化青椒葉多酚提取工藝時,需要重點控制超聲溫度。綜上所述,該研究的回歸模型準確性和可信度高,可用于青椒葉多酚的提取分析和預測。通過對該回歸模型進行擬合和優化,可以找到最佳的處理方案,以達到高效、經濟地提取青椒葉多酚的目標。

響應面分析用于研究多個因素對某個響應變量的影響[15],在該研究中,考察了乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度4個因素對青椒葉多酚提取率的影響,并繪制了響應面和等高線圖,以直觀地展示各因素之間的交互作用對青椒葉多酚提取率的顯著性程度。由圖5～10可以看出,響應面曲線最陡的是超聲時間和超聲溫度,其等高線偏離圓形也最厲害,說明對青椒葉多酚提取率影響最顯著的是超聲時間和超聲溫度的交互作用;而響應面曲線陡度次之的是超聲時間和液料比,其等高線偏離圓形的程度次之,說明超聲時間和液料比交互作用的顯著程度次之。同理可得,各因素交互作用影響的顯著性順序為BD> BC> AC> AB> CD> AD。這些發現對于優化青椒葉多酚提取過程具有重要意義,可為相關領域的研究提供有力的支持。

圖5 乙醇濃度和超聲時間交互作用對多酚提取率的影響

圖6 乙醇濃度和液料比交互作用對多酚提取率的影響

圖7 乙醇濃度和超聲溫度交互作用對多酚提取率的影響

圖9 超聲時間和超聲溫度交互作用對多酚提取率的影響

2.2.2 最優條件驗證

經過回歸方程計算,提取青椒葉多酚的最佳工藝為乙醇濃度70.89%,超聲時間40.53 min,液料比24.94∶1(mL∶g),提取溫度70.52 ℃。在此工藝條件下,青椒葉多酚提取率預測值可達到67.76 mg/g。為了驗證模型預測的可靠性,根據實驗操作的便利性,將各因素工藝條件修正為乙醇濃度71%,超聲時間41 min、液料比25∶1 (mL∶g)和提取溫度71 ℃,并進行3次試驗。試驗結果表明,青椒葉多酚的提取率平均值為67.62 mg/g。與模型預測值相比,其相對誤差僅為0.21%,證明基于響應面分析方法優化青椒葉多酚提取工藝的有效性和可行性[16]。這一研究成果為青椒葉多酚的提取和開發提供了新的思路和方向,具有重要的理論和實踐價值。

2.3 青椒葉多酚的抗氧化能力

2.3.1 多酚對DPPH自由基的清除效果

青椒葉多酚和抗壞血酸的抗氧化能力可以通過對DPPH自由基的清除率來進行評估[17](圖11)。結果表明,隨著青椒葉多酚和抗壞血酸質量濃度的增加,對DPPH自由基的清除率也逐步升高。尤其是在青椒葉多酚質量濃度為100 mg/L時,其清除率可達到78.21%,顯示出其強大的DPPH自由基清除能力。此外,青椒葉多酚和抗壞血酸對DPPH自由基清除率的半抑制質量濃度(IC50)分別為56.34和46.79 mg/L,說明青椒葉多酚能夠有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性與多酚濃度呈正相關。

圖11 抗壞血酸和多酚對DPPH自由基的清除效果

2.3.2 多酚對OH自由基的清除效果

青椒葉多酚和抗壞血酸的抗氧化能力可以通過對OH自由基的清除率來進行評估(圖12)。結果表明,隨著青椒葉多酚和抗壞血酸質量濃度的增加,對OH自由基的清除率也逐步升高,尤其是青椒葉多酚質量濃度為250 mg/L時,其清除率可達到80.41%,顯示出其強大的OH自由基清除能力。此外,青椒葉多酚和抗壞血酸對OH自由基清除率的IC50分別為125.20和96.14 mg/L,說明青椒葉多酚能夠有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性與多酚濃度呈正相關。

圖12 抗壞血酸和多酚對OH自由基的清除效果

以上試驗結果為青椒葉多酚的抗氧化能力提供了可靠的科學依據,為其在保健品和食品工業等領域的應用提供了參考。

3 結論

該研究使用超聲波輔助法提取青椒葉多酚,通過單因素試驗和響應面法分析,建立了多酚提取率和考察工藝之間的回歸模型。最終,優化得出了提取多酚的最佳工藝條件為:乙醇濃度71%、超聲時間41 min、液料比25∶1(mg∶L)和提取溫度71 ℃,并進行了3次實驗,青椒葉多酚的提取率平均值為67.62 mg/g。與模型預測值相比,其相對誤差僅為0.21%,基于響應面分析方法,成功地優化了青椒葉多酚的提取工藝,并證明了該方程的有效性和可行性。青椒葉多酚能夠有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性與多酚濃度呈正相關,青椒葉多酚和抗壞血酸對DPPH自由基清除率的半抑制質量濃度IC50分別為56.34和46.79 mg/L,對OH自由基清除率的半抑制質量濃度IC50分別為125.20和96.14 mg/L,該研究為青椒葉多酚的抗氧化能力提供了可靠的科學依據,為其在保健品和食品工業等領域的應用提供了參考。