酪蛋白膠束與多元活性分子的相互作用及其復合物特性

鄭 杰，楊 敏,2,*，甄晨波，秦娟娟

（1.甘肅農業(yè)大學理學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業(yè)大學農業(yè)資源化學與應用研究所，甘肅 蘭州 730070）

原花青素（proanthocyanidin，PC，圖1A）是自然界廣泛存在的一種類黃酮化合物，是構成植物果實、花瓣等組織顏色的主要水溶性色素。PC由不同數(shù)量的兒茶素（catechin，Cat）或表兒茶素聚合而成。依據(jù)不同的聚合度，可將PC分為單體、低聚物和高聚物，其中二聚體分布最廣。研究表明，PC具有抗氧化、抗過敏、降血糖等多種生理活性[1]。此外，PC還被作為天然色素，廣泛應用于食品工業(yè)。Cat（圖1B）為PC結構的組成單元，是從茶葉中提取的一種天然黃酮類化合物，不但具有較強的抗炎、抗菌、抗氧化作用，還具有預防心腦血管疾病、抑制癌細胞增殖等功效[2-3]。葉綠素銅鈉（chlorophyllin sodium copper salt，Chl，圖1C）為葉綠素的衍生化合物，是一種允許添加在食品中的水溶性天然色素，且具有抗炎、抗菌、清除自由基、促進細胞新陳代謝等生物活性[4]。

圖1 PC（A）、Cat（B）、Chl（C）的分子結構Fig.1 Molecular structures of PC (A),Cat (B),and Chl (C)

上述分子是常見的食源活性分子，因具有優(yōu)異的生物活性、來源廣泛和食用安全等優(yōu)點，受到眾多研究者的青睞。然而，它們穩(wěn)定性差，在加工過程中易受光、熱、pH值、氧化劑、酶等因素的影響而發(fā)生降解或者結構改變。此外，PC、Cat、Chl還表現(xiàn)出脂溶性差、親水性強的性質，使其在親脂體系中的應用較少[3,5-6]。以上諸多因素都限制了其在醫(yī)藥、食品等領域的使用。

針對上述問題，眾多研究者以大分子作為基質，采用乳化、噴霧干燥、酸化等技術構建出乳液、微膠囊、凝膠等不同類型的載體，通過物理作用對活性分子進行保護，在既不影響活性分子天然結構、又不會產生新的可能具有潛在危害物質的同時提高其穩(wěn)定性及生理活性。研究表明，人工合成的兩性多肽負載PC后，顯著改善了PC對堿、金屬離子和高溫的敏感性[7]。黑豆分離蛋白的負載提高了PC的熱穩(wěn)定性[8]。玉米醇溶蛋白/殼聚糖納米顆粒負載顯著提高了Cat衍生物的抗氧化活性，并實現(xiàn)了對其的控釋[9]。大豆分離蛋白負載后，Chl的穩(wěn)定性有效提升[10]。由此可見，大分子負載可有效改善活性分子的穩(wěn)定性及生物活性。然而，已有報道中的大分子載體及其對活性分子的負載均需要通過多個步驟實現(xiàn)，致使負載工藝復雜、成本高。另外，現(xiàn)有研究主要集中于載體對一種活性分子的負載方面，其對多元分子的負載研究較少。因此，有必要尋求一種天然大分子基質，無需復雜的構建和負載工藝即可實現(xiàn)多個活性分子的負載。

酪蛋白是動物乳中特有的一種含磷、鈣的結合蛋白質，由4 種不同類型單體組成（αs1∶αs2∶β∶κ＝4∶1∶4∶1）。4 種單體間通過非共價相互作用以及鈣橋形成直徑約為80～400 nm的超分子膠束粒子，稱為酪蛋白膠束（casein micelles，MC）；MC具有“內部疏水、外部親水”的特殊空間結構，是天然納米載體的首選基質之一[11]。MC具有活性分子的多個作用位點，由于其為多孔型納米顆粒，活性分子不僅可以結合于MC表面的肽鏈上，還可以進入結構內部，與多肽鏈結合，且形成交聯(lián)作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MC對大黃素[12]、咖啡酸及咖啡酸苯乙酯[13]均表現(xiàn)出較強的結合作用；另外，也有研究指出，MC具有負載VD2、VD3的能力，可通過負載提升活性分子的溶解性、穩(wěn)定性以及生物活性[14-15]。

截至目前，MC與小分子的結合作用研究主要集中于單一分子，其對多種分子的結合作用及負載能力尚不清楚。而多種活性分子聯(lián)合使用可能會產生協(xié)同作用，對人體健康產生多種益處[16]。例如，β-乳球蛋白與香草酸、阿魏酸、槲皮素形成的三配體復合物表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性與抗氧化活性，且三配體復合物的抗氧化性顯著強于單一配體[17]。β-乳球蛋白同時負載PC B2和二氫楊梅素，具有增強活性分子穩(wěn)定性和協(xié)同細胞毒性的作用[18]。

本研究在前期研究的基礎上，選擇了食源色素PC和Chl，以及PC的結構單元Cat作為模型分子，采用熒光分析法系統(tǒng)分析熱處理和熱處理聯(lián)合超聲處理下MC與PC、Cat、Chl單一分子及其二元組合物的相互作用，對比3 種分子與MC的結合常數(shù)及結合作用力，分析MC負載過程中分子間的相互影響，探討MC對多元分子的同時負載能力。同時，研究二元及三元復合物的結構、表面形貌、熱穩(wěn)定性以及抗氧化性能，并評價復合物的體外模擬消化情況。研究結果可為MC在負載多元活性分子中的應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MC參照團隊前期研究方法[13]制備，將巴氏殺菌牛乳在4000×g離心30 min，所得脫脂乳進行膜過濾，截留分子質量為100 kDa，跨膜壓力為0.4 MPa，流速為 480 L/h。收集截留濃縮液后冷凍干燥至質量恒定，即得MC，其蛋白質質量分數(shù)為（83.26±1.87）%。

PC、(＋)-Cat、Chl、胃蛋白酶（15000 U/mg）、胰蛋白酶（2500 U/mg）上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

NAI-GZJ型實驗室小型噴霧干燥機 上海那艾精密儀器有限公司；RF-5301PC熒光分光光度計、S-3400N掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本日立公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）美國賽默飛世爾科技公司；STA 449 F5熱重-差示掃描量熱分析儀（thermogravimetric-differential scanning calorimetry，TG-DSC）德國耐馳儀器制造有限公司；SFX550超聲處理儀 美國布蘭森超聲波公司；DYY-6D型電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 二元、三元復合物的制備

二元復合物的制備：將MC溶解于0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.86）中，制備質量濃度為2 g/L的儲備液。將PC充分溶解于0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.86），制備濃度為0.004 mol/L PC溶液。取不同體積PC溶液與20 mL MC溶液混合，用空白緩沖溶液補充，使混合液體積相等，分別置于298、310、318 K水浴中恒溫處理20 min，即為熱處理組；混合液分別置于298、310、318 K水浴中恒溫處理2 min后，將12.7 mm超聲波探頭置于樣品中心超聲處理1 min，超聲振幅為30%、脈沖開啟時間5 s、關閉時間1 s，即為熱處理聯(lián)合超聲處理組。處理后的溶液在避光條件下冷卻至室溫，貯存?zhèn)溆?；其中PC終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmol/L，記作PC-MC復合物。

Cat-MC、Chl-MC復合物的制備過程同PC-MC復合物制備過程。其中，混合溶液中Cat終濃度分別為0、100、200、300、400、500 μmol/L；Chl終濃度分別為0、10、20、30、40、50 μmol/L。

三元復合物的制備：首先制備出PC-MC 或Cat-MC 的二元復合物，其中PC、Cat 的終濃度分別為60、300 μmol/L（約為PC和Cat對MC熒光猝滅50%時的濃度，下同；MC終質量濃度為2 g/L）。將不同濃度Cat或PC分別加入PC-MC或Cat-MC二元復合物中，均勻混合后，分別進行熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理，形成相應的三元復合物記作PC-MC-Cat（Cat終濃度為0、100、200、300、400、500 μmol/L）或Cat-MC-PC（PC終濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L）。

PC-MC-Chl和Chl-MC-PC復合物的制備與上述方法相同，初始二元復合物中PC、Chl的終濃度分別為60、30 μmol/L（MC終質量濃度為2 g/L；PC-MC-Chl中Chl終濃度為0、10、20、30、40、50 μmol/L；Chl-MC-PC中PC終濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L）。

使用噴霧干燥機對復合物進行噴干處理，設定出口溫度130 ℃，物料流量300 mL/h，撞針間隔時間1 s。收集噴干后的粉末樣品冷藏備用。

1.3.2 熒光光譜分析

復合物內源熒光光譜由熒光分光光度計測定，激發(fā)波長280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，記錄樣品在300～500 nm區(qū)間的內源熒光光譜。通過Stern-Volmer方程（式（1））確定PC、Cat、Chl或其二元組合對MC內源熒光的猝滅機理[19]。

式中：F0、F分別為加入小分子前后的熒光強度；Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq為散射碰撞猝滅常 數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為不存在猝滅劑時熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命為10-8s；Q為小分子濃 度/（mol/L）。

PC、Cat、Chl與MC結合的結合常數(shù)（Ka）、結合位點數(shù)（n）通過雙對數(shù)方程（式（2））計算：

通過Van’t Hoff方程（式（3）、（4））計算MC與小分子結合反應的吉布斯自由能變（ΔG）、熵變（ΔS）和焓變（ΔH）：

式中：Ka為對應溫度下M C 與小分子的結合常 數(shù)/（L/mol）；R為理想氣體常數(shù)/（J/（K·mol））；T為處理溫度/K；ΔG為吉布斯自由能變/（J/mol）；ΔH為焓變/（J/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

1.3.3 FTIR測定

將復合物粉末置于衰減全反射（attenuated total reflection，ATR）元件，選擇分辨率為4 cm-1，在透射模式下采用FTIR儀掃描500～4000 cm-1之間的紅外光譜。

1.3.4 SEM測定

取適量復合物粉末置于銅臺上的導電膠條表面，小心涂抹使其分散為薄層，噴金后采用SEM觀察，電壓12.0 kV。

1.3.5 TG-DSC分析

參照Qin Juanjuan等[13]的方法。準確稱取4～6 mg樣品，以同規(guī)格空坩堝作為參比，測定復合物在25～500 ℃區(qū)間內熱穩(wěn)定性，升溫速率5 ℃/min。

1.3.6 抗氧化性分析

制備濃度為0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）儲備液。將3 mL DPPH自由基儲備液與0.4 mL復合物溶液均勻混合，室溫避光靜置20 min，測定混合液在517 nm波長處吸光度，記為A1；將3 mL無水乙醇與0.4 mL復合物溶液均勻混合，吸光度記為A2；將3 mL DPPH自由基儲備液與0.4 mL磷酸鹽緩沖液均勻混合，吸光度記為A0。按式（5）計算DPPH自由基清除能力[20]：

制備7.4 mmol/L 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）原液和2.6 mmol/L過硫酸鉀原液，將二者混合均勻并避光保存12 h；用pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，獲得ABTS陽離子自由基儲備液。將3 mL ABTS陽離子自由基儲備液與50 μL復合物溶液均勻混合后，室溫靜置6 min，測定混合液在734 nm波長處的吸光度。按式（6）計算ABTS陽離子自由基清除能力：

式中：A0為ABTS陽離子自由基儲備液與磷酸鹽緩沖液混合后的吸光度；As為ABTS陽離子自由基儲備液與復合物溶液混合后的吸光度。

1.3.7 體外模擬胃腸消化性分析

樣品的體外模擬消化性采用課題組已有方法測定，稍作修改[12]。將2 g氯化鈉和0.032 g胃蛋白酶溶解在1 L去離子水中，并用濃鹽酸將pH值調至1.2，得到模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）。在1 L去離子水中加入6.8 g磷酸二氫鉀和0.1 g胰蛋白酶，用氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至7.5，充分溶解后得到模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）。

將0.1 g復合物粉末置于10 mL試管中，加入2 mL SGF，37 ℃、130 r/min水浴振蕩120 min，每60 min取樣10 μL。模擬腸消化在相同條件下進行4 h，以20、40、60、120 min和240 min為時間節(jié)點，每次取樣10 μL[12]。將取出后的消化液與聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液1∶1混合均勻，水浴煮沸4 min，4000 r/min離心4 min，隨后將6 μL混合液注入凝膠軌道并在150 V恒壓下進行電泳，觀察MC的胃腸模擬消化情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)間差異顯著分析采用Duncan法，P＜0.05，差異顯著；數(shù)據(jù)以表示，所有數(shù)據(jù)至少為3 次實驗結果。

2 結果與分析

2.1 MC與PC、Cat、Chl的相互作用分析

2.1.1 熒光光譜分析

由圖2A1～A3、B1～B3可知，各條件處理組中，MC在336 nm（最大發(fā)射波長）處的熒光強度隨著分子濃度的增加而降低，表明活性分子與MC形成了復合物。此外，隨著Cat、Chl濃度的增加，MC的最大發(fā)射波長呈現(xiàn)藍移現(xiàn)象；而PC的加入則導致其紅移，說明PC的結合使MC上色氨酸殘基微環(huán)境親水性增強。相同條件處理下，Chl對MC的內源熒光猝滅效果最強，Cat最弱，表明MC與Chl之間的相互作用最強。盡管Cat是PC的結構單元，但它與MC的相互作用比PC弱，可能是由于PC結構中存在更多的黃酮單元，可與MC上不同肽鏈的氨基酸殘基間形成非共價作用。

圖2 熱處理（A）或熱處理聯(lián)合超聲（B）處理下 二、三元復合物熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of binary or ternary complexes with heat treatment (A) or combined heat and ultrasonic treatment (B)

三元復合物中，Cat和Chl的加入導致PC-MC復合物的最大發(fā)射波長發(fā)生藍移；但PC的加入導致Cat-MC和Chl-MC最大發(fā)射波長紅移，與它們對游離MC的影響相似（圖2A4～A7、B4～B7）。與游離MC相比，二元復合物最大發(fā)射波長的移動程度更大，表明二元分子的組合對MC的色氨酸微環(huán)境有更大的影響。

為了探究PC、Cat、Chl對MC內源熒光的猝滅機理，利用Stern-Volmer方程計算了Ksv和Kq[19]。由表1可知，各處理組中二元、三元復合物的Kq值遠大于最大Kq值（2.0×1010L/（mol·s）），表明3 種小分子及其二元組合物對MC內源熒光的猝滅機理均為靜態(tài)猝滅，形成了穩(wěn)定性較高的靜態(tài)復合物[21]。二元復合物Chl-MC的Ksv和Kq值均高于PC-MC和Cat-MC，這與熒光強度的變化趨勢一致。此外，三元復合物的Ksv和Kq值與二元復合物接近，表明MC具有同時結合兩個分子的能力。

表1 熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下PC、Cat和Chl對MC的結合參數(shù)Table 1 Binding parameters of MC to PC,Cat or Chl with heat treatment or combined heat and ultrasonic treatment

2.1.2 結合常數(shù)和結合位點數(shù)分析

對于靜態(tài)猝滅機制，Ka與n可通過雙對數(shù)方程計算，結果如表1所示。相同條件處理下，二元復合物的Ka值均隨溫度的升高而升高，表明結合過程為吸熱過程。此外，兩種處理條件下，PC-MC、Cat-MC、Chl-MC在各溫度下的Ka值均高于103，且遵循Chl＞PC＞Cat，表明MC對Chl具有更強的親和力。PC與MC的Ka值高于其與β-酪蛋白的Ka（103），與β-乳球蛋白的Ka[22-23]相似。Cat和MC的Ka值高于其與大豆分離蛋白（102）和β-乳球蛋白的Ka值[24-25]。Chl和MC的Ka值高于其與大豆蛋白的Ka值（104）[10]。此外，MC對大黃素、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯也表現(xiàn)出較強的結合作用[12-13]。可見，MC是一種生物活性分子的天然納米載體。

Chl-MC復合物在熱處理條件下的Ka值高于熱處理聯(lián)合超聲處理，而Cat-MC復合物的Ka則表現(xiàn)出相反的趨勢。這可能是因為MC和Chl之間的強相互作用導致Chl很容易與MC結合，而超聲波產生的空化作用削弱了二者間的結合作用。對于Ka值較低的Cat而言，超聲產生的空化作用通過增加它們的碰撞加速Cat與MC結合。此外，由于其分子體積小，空化作用可以使Cat輕松進入膠束內部區(qū)域并與MC牢固結合。

除熱處理聯(lián)合超聲處理下的PC-MC-Chl復合物外，在三元復合物中，第2個分子結合的Ka值隨處理溫度的增加而減小，這表明低溫有助于三元復合物的形成。此外，298 K熱處理條件下，Chl和Cat與二元復合物結合的Ka值比它們與游離MC結合的Ka值大，而PC的Ka值變化與此相反，這可能是由于PC分子體積較大，其與MC的結合域與其他分子不同所致?？偟膩碚f，MC可以連續(xù)結合兩個生物活性分子，并具有較單一分子高或相似的結合強度。298 K時，熱處理下的三元復合物的Ka值高于熱處理聯(lián)合超聲處理，這表明當MC與一個分子結合后，超聲處理不利于另一個分子的結合。

由表1可知，MC上有一個PC或Cat的結合位點。PC-β-乳球蛋白和Cat-大豆分離蛋白也表現(xiàn)出類似的 結果[23-24]。MC上Chl的結合位點數(shù)較PC和Cat多，表明Chl與MC產生結合作用的基團比PC、Cat更多。298 K熱處理條件下，三元復合物的結合位點數(shù)也接近1，且相較于二元復合物表現(xiàn)出較大或相近的結合位點數(shù)。進一步證實，第一個活性分子的結合有利于另一個分子與MC的結合。

2.1.3 熱力學參數(shù)分析

蛋白質與酚類化合物的結合方式可通過熱力學參數(shù)判定。采用Van’t Hoff方程計算得到的二元、三元復合物形成過程的熱力學參數(shù)，如表1所示。各條件處理組中，二元復合物形成過程中ΔH和ΔS均為正值，表明PC、Cat、Chl與MC之間的結合方式主要以疏水作用為主。熱處理條件下，第2個分子與MC結合的ΔH和ΔS均為負值，即MC以疏水作用與一個分子結合后，另一個分子則以范德華力和氫鍵與之結合。由于第1個分子已經占據(jù)了MC上易于結合的疏水位點，另一個分子只能以其他方式結合在其他位點上。然而，超聲處理下，Chl仍然以疏水作用與PC-MC結合，這是因為PC和Chl的體積較大，PC結合在MC的疏水位點后，受PC體積和超聲波的雙重作用，MC的結構變化較大，由于位阻效應，不能在臨近位置繼續(xù)結合第2個分子。因此，第2個分子可能結合于MC的其他疏水位點。受到超聲波的影響，第2個分子與MC的結合作用弱于其單獨與MC的結合作用。但是，二元、三元復合物的ΔG均為負值，表明復合物的形成均為自發(fā)過程，證明MC具有自發(fā)結合多個活性分子的能力，這與其特殊的納米結構有關。

2.2 多元復合物的結構表征

2.2.1 FTIR分析

如圖3所示，游離PC、Cat在1604 cm-1處為C＝C 的伸縮振動，1518 cm-1處為C＝C骨架的伸縮振動，1440 cm-1處為C—H的彎曲振動[26-27]；游離Chl在2975 cm-1處為CH3的不對稱C—H伸縮振動，2855 cm-1處為醛基的伸縮振動，1525 cm-1和1356 cm-1處為卟啉環(huán)的C—C和C—N骨架振動[28]。MC中，酰胺I（1640 cm-1）和酰胺II帶（1514 cm-1）的位置分別與蛋白質的C—O和N—H的伸縮振動有關[12]。MC與PC、Cat、Chl在不同處理條件下結合后，酰胺I、II帶未出現(xiàn)明顯的偏移，但PC、Cat、Chl的特征峰均消失，三元復合物也表現(xiàn)出類似的變化。這可能是由于MC自身結構穩(wěn)定性高，低濃度的PC、Cat、Chl通過物理作用結合在MC表面或孔隙間，從而對其酰胺帶沒有產生顯著影響。前期研究表明，MC與葛根素/黃豆苷元結合后，其酰胺帶也未發(fā)生明顯變化[29]。

圖3 熱處理（A）或熱處理聯(lián)合超聲（B）處理下復合物的FTIR圖Fig.3 FTIR spectra of complexes with heat treatment (A) or combined heat and ultrasonic treatment (B)

2.2.2 SEM分析

如圖4所示，游離PC表現(xiàn)為帶有厚壁的光滑球體，部分球體因噴干時內部水分子揮發(fā)皺縮而破裂；游離Cat和Chl則呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀。經噴霧干燥后，MC和二元、三元復合物呈葡萄干狀，粒徑介于5～25 μm之間。超聲處理后，因MC空間結構變得緊湊，尺寸略有減小[30]。但二元、三元復合物未表現(xiàn)出類似的現(xiàn)象。這可能是由于結合的PC、Cat、Chl起到了穩(wěn)定MC空間結構的作用。此外，與MC相比，Cat較小的分子結構使得二元復合物Cat-MC在熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下均表現(xiàn)出粒徑較小、粒度趨于均勻的特點。

圖4 未經任何處理（A）、熱處理（B）或熱處理聯(lián)合超聲處理（C）游離PC、Cat、Chl及其二、三元復合物的SEM圖Fig.4 SEM images of free PC,Cat,Chl and their binary or ternary complexes without treatment (A),with heat treatment (B) or combined heat and ultrasonic treatment (C)

2.3 多元復合物性質分析

2.3.1 熱穩(wěn)定性分析

如圖5所示，不同條件處理下，游離PC、Cat、Chl與MC及其復合物在50～100 ℃之間均存在一個明顯的吸熱峰，這是由于少量水分蒸發(fā)所致。隨著溫度的升高，PC和Chl的DSC曲線沒有出現(xiàn)明顯的晶體熔融吸熱峰，表明它們具有無定形結構。Cat的DSC曲線具有樣品熔化的吸熱峰以及與類黃酮氧化和降解相關的放熱峰[31]。與MC相互作用后，PC、Cat、Chl的特征吸熱峰消失，二元、三元復合物表現(xiàn)出與游離MC相似的蛋白寬峰特征曲線。

由圖6 可知，P C 在150～425 ℃的質量損失為28.43%；Chl在225～425 ℃的質量損失為23.31%；而Cat在200～280 ℃的質量損失為6.98%，在280～425 ℃的質量損失為22.05%。MC在熱處理下于225～425 ℃的質量損失為63.28%，熱處理聯(lián)合超聲處理下為58.11%，表明超聲處理改善了MC的熱穩(wěn)定性；這可能與超聲處理使MC的空間結構變得緊湊有關。二元、三元復合物的TG曲線與游離MC相似，分別在50～100、100～200 ℃和225～425 ℃ 3 個階段出現(xiàn)質量損失：第1階段是由于水的蒸發(fā)，第2階段是由于PC、Cat、Chl和MC之間的相互作用被破壞，第3階段是由于PC、Cat、Chl和MC的熱分解。熱處理條件下，二元、三元復合物的質量損失低于游離MC，而熱處理聯(lián)合超聲處理則表現(xiàn)出相反的趨勢，表明在熱處理條件下活性分子的結合增加了MC的熱穩(wěn)定性。

圖6 熱處理（A）或熱處理聯(lián)合超聲（B）處理下復合物的熱穩(wěn)定性Fig.6 TG curves of complexes with heat treatment (A) or combined heat and ultrasonic treatment (B)

2.3.2 抗氧化性分析

如圖7A所示，3 種分子對DPPH自由基的清除能力顯著高于同濃度VC，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。PC、Cat、Chl二元或三元復合物均表現(xiàn)出良好的DPPH自由基清除活力，但低于游離分子和MC的DPPH自由基清除力的總和，說明二者的結合位點與DPPH自由基清除有關。與MC結合后，復合物對DPPH自由基的清除能力隨處理條件不同表現(xiàn)出顯著差異。熱處理條件下，MC與PC、Cat、Chl相互作用強于超聲處理，因此熱處理復合物的DPPH自由基清除率低于相同濃度游離分子的清除率。三元復合物的DPPH自由基清除力變化趨勢與二元復合物一致，且均大于二元復合物的活性。此外，PC，Cat和Chl的添加順序不會對三元復合物的清除能力產生顯著影響，說明不同活性分子都是獨立結合于MC的不同位點，其抗氧化性沒有拮抗作用。如圖7B所示，相較于VC，3 種分子對ABTS陽離子自由基均表現(xiàn)出較強的清除能力。不同條件處理下，二元、三元復合物對ABTS陽離子自由基的清除能力遵循以下順序：熱處理組＞熱處理聯(lián)合超聲處理組＞游離分子。ABTS陽離子自由基屬于親水性自由基，通常用于確定抗氧化劑屬于氫原子轉移還是單電子轉移[13]。MC與活性分子均以疏水作用結合，其親水基團不受影響，因此活性分子的ABTS陽離子自由基清除力沒有被削弱。熱處理下，MC與活性分子結合作用較強，更有利于活性分子的親水基團發(fā)揮ABTS陽離子自由基清除活力。此外，超聲處理對MC空間結構的影響也是導致ABTS陽離子自由基的清除能力低于熱處理的原因之一。三元復合物的ABTS陽離子自由基清除能力變化趨勢與二元復合物一致，且顯著高于二元復合物，證明MC可以同時高效結合多個活性分子，且對活性分子的抗氧化性無拮抗作用，是一種性能較好的天然載體。

圖7 熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下復合物的DPPH自由基（A）和ABTS陽離子自由基（B）清除能力Fig.7 DPPH radical (A) and ABTS radical cation (B) scavenging capacity of complexes under heat treatment or combined heat and ultrasonic treatment

2.4 復合物的體外模擬消化性分析

因熱處理條件下MC對活性分子的結合作用較強，選擇熱處理下的復合物為樣品，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其不同時間段的模擬胃腸消化產物。如圖8所示，游離MC的電泳條帶主要為α-酪蛋白和β-酪蛋白[32]。SGF中消化120 min時，少量MC被SGF中的胃蛋白酶消化。二元、三元復合物在SGF中也表現(xiàn)出類似的消化結果，說明小分子結合不影響MC在SGF中的消化速率。

圖8 復合物體外模擬消化產物的電泳圖Fig.8 Electropherogram of digestion products of complexes during simulated gastrointestinal digestion

在SIF中，游離MC的α-酪蛋白和β-酪蛋白含量隨消化時間的延長逐漸減少，消化240 min后被完全水解。二元復合物在SIF中的消化趨勢與游離MC一致。相較于PC-MC與Chl-MC，Cat-MC復合物在各時間段的消化程度較低，這可能是因為Cat分子體積較小，其與胰蛋白酶的接觸面積較大，且具有潛在的胰蛋白酶抑制性，因此降低了MC的消化速率[33]。

就三元復合物而言，其消化性強于二元復合物，表明三元復合物的形成對MC的空間結構影響大于二元復合物，多個活性分子的結合打開了MC的肽鏈，更有利于酶與其接觸，加劇了MC的水解。因此，多個活性分子的結合改善了MC的消化性。

3 結論

MC可自發(fā)與PC、Cat、Chl或其二元組合物形成穩(wěn)定的二元或三元復合物。在熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下，MC與PC、Cat、Chl的結合作用為疏水相互作用，且MC對Chl的結合作用最強。熱處理條件下，當MC與PC、Cat、Chl結合后，另一個分子以范德華力和氫鍵與MC結合，且298 K下第1個分子的結合提升了第2個分子與MC的結合常數(shù)和結合位點數(shù)。然而，熱處理聯(lián)合超聲處理卻降低了第2個分子的結合常數(shù)。MC結合PC、Cat、Chl或其二元組合物后，噴干物形貌并未發(fā)生顯著變化。此外，PC、Cat、Chl的結合提高了MC的熱穩(wěn)定性。

熱處理和熱處理聯(lián)合超聲處理對PC/Cat/Chl-MC二元及三元復合物的抗氧化性影響規(guī)律不同。熱處理改善了復合物的ABTS陽離子自由基清除力，但削弱了其DPPH自由基清除活性；超聲處理的作用結果與熱處理相反。然而，兩種處理條件下，三元復合物的抗氧化性均高于二元復合物。Cat的結合降低了MC在SIF中的消化性，但二元活性分子的同時結合對MC的SIF消化性具有改善作用。

綜上所述，MC對多種分子表現(xiàn)出較高的親和性，可實現(xiàn)多種活性分子的同時負載，且不影響結合常數(shù)，也不會對活性分子的抗氧化性產生拮抗作用，是一種性能優(yōu)異的天然納米級活性分子載體，在功能食品設計和開發(fā)方面具有潛在的應用前景。