牛蒡果膠多糖/玉米醇溶蛋白復合顆粒穩定的 Pickering乳液構建及對姜黃素的遞送功效

吳 彤，馮 進，黃午陽，汪 晶，李 瑩,，陳小娥

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.南京林業大學化學工程學院，江蘇 南京 210014）

Pickering乳液是固體顆粒穩定的乳液[1]。由于乳化劑顆粒以不可逆的形式吸附于油-水界面，因此與傳統乳液相比，它的聚結和奧斯瓦爾德熟化抵抗性更強[2]。并且，界面顆粒形成的三維致密屏障可以將分散相與外界環境有效阻隔，提升包封材料的穩定性。近年來，Pickering乳液在食品領域中的應用受到了極大的關注，比如活性因子遞送、氫化植物油替代、肉糜凝膠結構調控以及3D打印等[3-4]。與無機納米顆粒相比，通過多糖、蛋白質等食物來源生物高分子組裝形成的Pickering穩定劑、安全劑、生物相容性以及可降解性更加突出。

牛蒡是一種藥食同源植物，有較高的營養價值，其藥用和保健功能也備受關注。多糖是牛蒡中重要的活性物質，在食品和醫藥等領域有廣闊的應用前景，提取后，發現牛蒡多糖具有高鼠李糖半乳糖醛酸I（rhamnogalacturonan I，RG-1）含量特征，有助于增強人體的免疫系統并改善代謝功能，具有降血脂、降血糖、抗癌、抗炎等生理功能，可作為防治腫瘤、冠心病、糖尿病、抗炎等的保健食品配料和天然藥物，適合用作制備Pickering乳液，負載活性物質。而玉米醇溶蛋白作為玉米加工工業中的副產物，由9 個相鄰且反方向平行的螺旋通過谷胱酰胺殘基聯接形成圓柱形結構，其中包含70%～80%的非極性氨基酸，常作為疏水內核用于核殼結構遞送體系[5-6]。玉米醇溶蛋白廉價易得，可以有效降低Pickering構建的成本。由于其疏水性較強，玉米醇溶蛋白一般經過理化改性或者與其他親水材料復合形成顆粒后作為Pickering乳化劑使用。Wang Dandi等[5]通過反溶劑法構建了玉米醇溶蛋白納米顆粒用于穩定Pickering乳液。結果表明，堿性條件預處理玉米醇溶蛋白可以獲得更好的良好膠體穩定性和再分散性，從而有效降低納米顆粒的疏水性，提升其在油水界面的吸附能力[5]。在另一篇報道中，Dai Lei等[7]發現玉米醇溶蛋白和阿拉伯膠可以通過氫鍵和靜電相互作用形成核-殼結構的納米顆粒。與阿拉伯膠復合后，玉米醇溶蛋白納米顆粒在水-油界面的三相角θo/w由原來的133.75°降低至88.95°，親水/疏水性更加平衡。當油相體積分數（φ）高于0.5時，由于體系黏度的增加形成了乳液凝膠[7]。此外，關于玉米醇溶蛋白與殼聚糖[8]、黃原膠[9]和果膠[10]等多糖組裝形成的Pickering穩定劑已有報道。但鮮見利用牛蒡多糖與玉米醇溶蛋白組成Pickering穩定劑的報道。

課題組前期實驗中，通過纖維素酶/果膠酶從牛蒡中分離得到了富含RG-1結構域的果膠型多糖。與工業中廣泛使用的同型半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）型果膠不同，RG-1型果膠的含有大量阿拉伯糖和半乳糖中性側鏈，呈分枝狀結構，其電荷密度較低，疏水性相對較強。有研究表明，RG-1型果膠可以更加有效的緩解腸道炎癥狀態[11]。

本研究選擇牛蒡RG-1型果膠多糖與玉米醇溶蛋白組裝形成的納米顆粒作為Pickering乳化劑，首先系統研究了多糖質量濃度、溶液pH值、φ、離子強度等對Pickering乳液穩定性的影響；其次，使用高內相Pickering乳液作為姜黃素遞送體系，研究了鈣離子交聯對體系流變學特性和姜黃素生物利用度的影響規律。這對拓展RG-I型果膠多糖與玉米醇溶蛋白形成的納米顆粒Pickering乳液在食品遞送體系中的應用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白、姜黃素 上海源葉生物科技有限公司；牛蒡購自徐州市豐縣；玉米油 江蘇省南京市蘇果超市；無水乙醇、鹽酸 南京化學試劑股份有限公司；膽酸鈉、胰酶 阿拉丁試劑（上海）有限公司；其余試劑（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BX-1F磁力攪拌器、全溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司；高速勻漿機、pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JEM-1230型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）日本電子株式會社；Zetasizer Nano ZS90納米粒度儀、MasterSizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；Cnoptec-B302正置生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限責任公司；UV-6300型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器公司；H3-16KR臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；Discovery HR10混合流變儀 杭州漢澤儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡RG-1型果膠多糖的制備

取新鮮牛蒡粉，加入5 倍質量80%乙醇溶液，50 ℃攪拌2 h，離心去除上清液；再加入5 倍質量100%乙醇，50 ℃攪拌2 h，離心去除上清液，40 ℃條件下烘干。稱取適量牛蒡粉，加入質量比20∶1的水分散均勻，調節pH值為6；加入0.6%低溫α-淀粉酶45 ℃水浴加熱40 min，調節pH值為4.5；在60 ℃水浴加熱的情況下加入1%糖化酶反應40 min；然后在100 ℃水中滅酶5 min，冷置過夜再勻漿。將上述溶液凍干，將1 g凍干粉末分散到50 mL的醋酸鈉緩沖液中（10 mmol/L，pH 4.8），加入50 mg纖維素酶，然后按照100 μL/200 mL的量加入多聚半乳糖醛酸內切酶。在300 r/min振蕩條件下，50 ℃反應24 h，然后在100 ℃水中滅酶5 min。用氫氧化鈉調至pH 6.5，濃縮后，在上清液中加入適當體積的脫蛋白溶劑（氯仿和正丁醇的體積比為4∶1），混合，分離去除有機溶劑層和變性蛋白層，重復1 次。在上清液中加入1 倍體積的乙醇，4 ℃醇沉過夜后，5000×g離心，沉淀用無水乙醇洗滌兩次，繼續溶解于水中，醇沉后得到牛蒡RG-1型果膠多糖。實驗室自制RG-1型果膠多糖提取率為10.34%，其中HG型結構域占比為（16.48±0.23）%，RG-1型結構域占比為（73.46±1.09）%。

1.3.2 牛蒡RG-1型果膠多糖/玉米醇溶蛋白Pickering 穩定劑的制備

參考Zeng Tao等[10]的反溶劑法制備RG-1型果膠/玉米醇溶蛋白納米顆粒。稱取6.0 g玉米醇溶蛋白溶解于20 mL 80%乙醇溶液配制成質量濃度0.3 g/mL的溶液；配制質量濃度為0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL和10 mg/mL 的果膠多糖溶液。在快速攪拌狀態下，將1.0 mL玉米醇溶蛋白乙醇溶液緩慢滴加于9.0 mL多糖溶液中，室溫條件下持續攪拌2 h促進納米顆粒的自組裝。將體系中的乙醇旋轉蒸發去除，并用蒸餾水將溶液總體積補足為10 mL，最終形成0.03 g/mL玉米醇溶蛋白溶液與質量濃度為0、1.8、3.6、5.4、7.2 mg/mL和9 mg/mL 的牛蒡果膠多糖水溶液混合。檢測產品的水動力學直徑（hydrodynamic diameter，DZ）、多分散系數（polydispersity index，PDI）和Zeta電位。

1.3.3 Pickering乳液特性測定

分別取1.3.2節中Pickering穩定劑（果膠多糖質量濃度為0～10 mg/mL）10 mL與2.5 mL玉米油混合，在12000 r/min條件下勻漿5 min形成Pickering乳液。使用電子顯微鏡觀察油滴形貌特征、激光粒度儀檢測尺寸D90變化。控制制備Pickering穩定劑時，果膠多糖質量濃度為10 mg/mL，使用1.0 mol/L HCl和NaOH溶液將穩定劑調至pH 2～8，隨后分別加入2.5 mL玉米油，勻漿制備Pickering乳液，觀察油滴形態和尺寸變化；在乳液中滴加高濃度的NaCl水溶液，使最終濃度達到40、80、120、160 mmol/L和200 mmol/L；觀察油滴形態和尺寸變化。制備Pickering穩定劑時果膠多糖質量濃度為10 mg/mL、pH 3.0，加入不同體積的玉米油使得φ分別達到0.09、0.17、0.23、0.28、0.33、0.50、0.67和0.75，觀察油滴形態和尺寸變化。

1.3.4 Pickering乳液動態界面張力測定

采用懸滴法測定牛蒡多糖與玉米蛋白溶液與正十四烷之間的動態界面張力。光學接觸角記錄了油水-界面的變化，并利用Young-Laplace方程計算了界面張力。對照使用蒸餾水。利用光學接觸角儀在25 ℃研究油-水界面壓力（π）。體積相（溶液）和油相分別置于試管和注射器中。實驗前，分散劑和油被允許放置至少30 min達到25 ℃，并通過恒溫器中的循環水持續保持整個系統的溫度。然后將10 μL樣品溶液滴入試管中，在針尖處放置3600 s以實現對樣品的吸附。液滴的圖像被連續地從相機的電荷耦合器件上拍攝并數字化。按式（1）計算π。

式中：γ0為純油-水的界面張力/（mN/m）；γ為油-溶液的界面張力/（mN/m）。

1.3.5 負載姜黃素高內相Pickering乳液的制備

將質量分數0.1%的姜黃素在90 ℃下充分溶解于玉米油中，并以此為油相制備φ為0.75的高內相乳液，并在持續攪拌條件下添加系列濃度（0、1、2、4、6 mmol/L）的鈣離子進行交聯。使用尼羅藍標記乳液界面層（油相使用荷載姜黃素標記），分別在530 nm和425 nm激發波長下使用轉盤式共聚焦激光顯微鏡觀察樣品熒光。

1.3.6 負載姜黃素高內相Pickering乳液的流變學特性測定

參考Yan Jun等[12]的方法并稍作修改。取少量乳液，在25 ℃、0.1～100 s-1剪切速率條件下，記錄黏度的變化情況。將剪切速率調至0.1 s-1，維持15 min，隨后將剪切速率調至10 s-1，維持10 min，再將剪切速率調整回0.1 s-1，維持10 min，記錄整個過程中黏度的變化情況。在25 ℃條件下，控制掃描頻率1.0 Hz，在0.1%～10%應變范圍掃描彈性模量（G′）和黏性模量（G″），確定線性黏彈區。在25 ℃下，選擇應變1%，在頻率0.1～10 Hz范圍內掃描G′和G″的變化情況。控制應變1%、頻率1.0 Hz，將樣品從5 ℃加熱到90 ℃冷卻回5 ℃，速率均為5 ℃/min，檢測G′和G″的變化情況。進一步使用Power-Law模型（式（2））分析。

式中：τ為剪切應力/Pa；K為流體的稠度系數/（Pa/s）；γ為剪切速率/s-1；n為流動指數/（Pa/s）。

1.3.7 高內相Pickering乳液中姜黃素的穩定性測定

將1.3.4節中制備的姜黃素乳液，在60 ℃條件下貯存7 d。姜黃素的提取和檢測方法[13]如下：準確吸取1.0 mL乳液，乙醇破乳后加入20 mL乙酸乙酯溶液進行萃取，吸取上清液，測定其在425 nm波長處的吸光度。根據線性回歸公式Y＝0.1616X＋0.0013（R2＝0.9995），計算姜黃素濃度，其中，Y為425 nm波長處吸光度，X為乙酸乙酯中姜黃素濃度。采用溶解姜黃素的純玉米油作為對照，用式（3）計算姜黃素的保留率。

1.3.8 姜黃素Pickering乳液的模擬消化研究

參考文獻[14-15 ]的方法制備模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）和腸液（simulated intestinal fluid，SIF）并稍作修改。SGF配方：41.4 mL 0.5 mol/L氯化鉀溶液、5.4 mL 0.5 mol/L磷酸二氫鉀溶液、75 mL 1.0 mol/L碳酸氫鈉溶液、70.8 mL 2 mol/L NaCl溶液以及2.4 mL 0.15 mol/L六水合氯化鎂溶液。SIF配方：34 mL 5.0 mol/L氯化鉀溶液、4.0 mL 0.5 mol/L 磷酸二氫鉀溶液、212.5 mL 1.0 mol/ L碳酸氫鈉溶液、48 mL 2.0 mol/ L NaCl溶液、5.5 mL 0.15 mol/ L 六水合氯化 鎂溶液。

取8.0 mL SGF與5.0 μL 0.1 mol/L氯化鈣溶液混合，加超純水至10 mL，隨后與10 mL溶解姜黃素的Pickering乳液充分混合，將體系調至p H 2.0，在37 ℃預熱30 min。加入0.1 g胃蛋白酶（分散在1.0 mL蒸餾水中）啟動胃消化，在37 ℃、120 r/min攪拌條件下反應60 min。

取10 mL模擬胃消化后的食糜與8.0 mL SIF混合，加入1.25 mL 160 mmol/L膽酸鈉溶液與20.0 μL 0.1 mol/L氯化鈣溶液，將溶液調至pH 6.8，37 ℃預熱30 min。加入0.3 g胰酶（分散在1.0 mL蒸餾水中）啟動消化，將體系調至pH 7.0，在37 ℃、120 r/min條件下反應2.0 h。反應過程中，連續檢測體系pH值，通過滴定NaOH溶液將體系維持在7.0。消化結束后，檢測食糜中姜黃素含量。將食糜在16000×g條件下離心分離上層膠束，并檢測膠束層姜黃素濃度。

按照式（4）～（6）計算姜黃素生物轉化率、生物可給率和生物利用度。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 牛蒡RG-1型果膠多糖質量濃度對Pickering乳液理化特征的影響

如圖1所示，牛蒡RG-1型果膠多糖/玉米醇溶蛋白納米顆粒穩定的Pickering乳液的乳化層高度與多糖質量濃度關系密切。當Pickering穩定劑中不含有多糖時，幾乎沒有乳化層形成，這可能是由于玉米醇溶蛋白納米顆粒的疏水性過強，在乳化過程中，大量的顆粒分布在連續相中但不能有效濕潤油水界面[16]。加入果膠多糖后，Pickering顆粒疏水性逐漸降低，對油水界面的穩定能力增強，乳液乳化層高度逐漸提升，同時油滴D90由果膠多糖質量濃度2.0 mg/mL時的750 μm左右降低至果膠多糖質量濃度10 mg/mL時的20 μm以下（圖1a）。由圖1c可知，在10 倍鏡圖像中，不含果膠多糖的乳液中油滴很少。隨著果膠多糖質量濃度增加，視野中油滴數量增加，并且形態更加規則、均一。此外，果膠多糖質量濃度為0、2 mg/mL時，油滴D90遠高于顯微鏡看到的油滴尺寸，這有可能與這兩個樣品中存在沉淀，未能滴加到載玻片上有關。因此，后續實驗選擇牛蒡果膠多糖質量濃度為10 mg/mL。

圖1 不同牛蒡果膠多糖濃度下Pickering乳液的尺寸（a）、外觀（b）和微觀形貌（c）的變化規律Fig.1 Size (a),appearance (b) and micromorphology (c) of Pickering emulsions with different concentrations of burdock RG-1-type pectic polysaccharides

2.2 pH值對Pickering乳液理化特性的影響

首先研究了pH值對Pickering顆粒DZ、PDI和Zeta電位的影響規律。由圖2a可知，溶液pH值由2升高到3時，果膠多糖/玉米醇溶蛋白Pickering顆粒DZ由183.3 nm增加到688.2 nm。在pH 2條件下，果膠多糖中糖醛酸羧基質子化現象比較明顯，與玉米醇溶蛋白之間的靜電相互作用有限。在pH 3條件下，果膠多糖通過靜電引力有效包覆在玉米醇溶蛋白表面，因此Pickering顆粒的尺寸較大。然而，隨著pH值進一步增加，Pickering顆粒DZ下降明顯。推測此時玉米醇溶蛋白表面的游離氨基發生了去質子化效應，攜帶負電荷增加，因此玉米醇溶蛋白和果膠多糖之間的靜電斥力增加，導致果膠多糖的吸附量降低。總體而言，在pH 2～8條件下，顆粒的PDI均維持在0.3以下，表明粒度的分布相對均一。由圖2b可知，Pickering顆粒的Zeta電位絕對值先隨著pH值的增加而增加，pH 4時達到最高值50.6，隨后隨著pH值的增加逐漸減少，這與顆粒表面果膠多糖吸附量減少有密切關聯。結合圖2c可知，不同pH值條件下顆粒的TEM圖像與DZ變化趨勢基本一致，pH 2.0時顆粒較小，主要呈圓形或者橢圓形的結構，pH 3時顆粒尺寸顯著增加，呈邊緣清晰的不規則結構，pH 5.0時顆粒尺寸顯著減少，pH值繼續增加至8.0時，Pickering顆粒輪廓更加模糊，DZ僅為238.32 nm，表明玉米醇溶蛋白表面的果膠多糖發生了嚴重的解吸附現象。

圖2 pH值對Pickering乳化劑DZ和PDI（a）、Zeta電位（b）以及 TEM圖像（c）的影響規律Fig.2 Effect of pH on the DZ,PDI (a),zeta potential (b),and TEM image (c) of RG-1-type pectin/zein emulsifiers

進一步研究了Pickering乳液外觀、油滴尺寸和形態與Pickering乳化劑pH值的內在關聯，如圖3所示。由 圖3b可知，乳化劑pH 2時，形成的Pickering乳液穩定性較差，pH 3～5時，Pickering乳液的乳化指數比較高，接近100%，然而pH值高于6時，乳化層高度僅占乳液總高度的1/3。根據前面研究，推測pH 2或者pH 6～8條件下，RG-1型果膠多糖未能充分包覆于玉米醇溶蛋白表面，因此顆粒的兩親性不佳，在油水界面的濕潤能力差[16]。由 圖3c可知，除了pH 6.0外，其他pH值條件下油滴的尺寸均較低，D90均在20 μm以下，而pH 6.0時乳液脂滴D90超過250 μm。這有可能是pH 6.0時，未能包覆在玉米醇溶蛋白表面的多糖引發了架橋絮凝。另外，pH 3～5條件下，電子顯微鏡視野中Pickering乳液脂滴較多且分布均一，pH 2.0以及6.0～8.0范圍內油滴數量極少（圖3a）。

圖3 Pickering穩定劑pH值對乳液的微觀形貌（a）、外觀（b）和 尺寸（c）的影響規律Fig.3 Influence of Pickering emulsifiers on the morphology (a),appearance (b),and dimension (c) of emulsions

2.3 離子強度對Pickering乳液理化性質的影響

由圖4a可知，在40～200 mmol/L NaCl濃度范圍內，離子強度對Pickering乳液外觀的影響不大。但隨著NaCl濃度的增加，油滴D90逐漸下降，NaCl濃度大于80 mmol/L后下降不明顯，趨于穩定。由 圖4b、c可知，增加離子濃度會影響乳液的尺寸，NaCl濃度較大的情況下，乳液的尺寸會變小，而乳液的電位在離子濃度為200 mmol/L時會較大；這可能是因為鹽的靜電屏蔽作用導致乳化劑顆粒攜帶電荷減少，使顆粒疏水相互作用提升，乳化層發生收縮[17-18]。從顯微圖像中可以看出（圖4d），隨著離子強度的增加，視野中顆粒密度逐漸降低且均一性變差，這有可能與高離子強度降低了顆粒的界面濕潤能力有關。

圖4 離子強度對乳液的尺寸（a）、DZ（b）、Zeta電位（c）和 微觀形貌（d）的影響規律Fig.4 Influence of ionic strength on the size (a),DZ (b),zeta potential (c) and micromorphology (d) of emulsions

2.4 φ對Pickering乳液理化特性的影響

由圖5可知，果膠多糖質量濃度10 mg/mL、pH 3條件下，隨著φ增加，Pickering乳液脂滴D90在15～30 μm范圍內波動（圖5c）。根據乳液外觀，φ越高，乳液的黏稠程度越強（圖5a），這與脂滴之間的距離縮小、產生了強大的范德華力等非共價相互作用有關[19]。當φ達到0.67和0.75時，貯藏乳液的玻璃瓶倒置后乳液不會滑落，凝膠狀的Pickering乳液的形成也預示著絮凝的脂滴形成了致密的三維網狀結構。隨著φ增加，視野中油滴的密度不斷提高（圖5b）。

圖5 φ對乳液的外觀（a）、微觀形貌（b）和尺寸（c）的影響規律Fig.5 Influences of φ on the appearance (a),micromorphology (b) and dimension (c) of emulsions

下標1～8.φ分別為0.09、0.17、0.23、0.28、0.33、0.50、0.67和0.75。

2.5 不同果膠多糖濃度對Pickering乳液動態界面張力的影響

由圖6可知，玉米蛋白的添加改變了牛蒡多糖的表面性質，影響了其油-水界面行為。所有溶液的π會隨時間逐漸延長，這與納米顆粒吸附到油水界面上有關。水的界面張力為γ0＝30.35 mN/m（30 min后），當牛蒡多糖的質量分數為0 mg/mL時，π最小。而隨著牛蒡多糖質量濃度增加，π逐漸上升，吸附油-水界面的能力更強。

圖6 不同果膠多糖質量濃度復合顆粒對動態界面張力的影響Fig.6 Effect of composite nanoparticles with different concentrations of RG-1-type pectic polysaccharide on dynamic interfacial tension

2.6 負載姜黃素的高內相Pickering乳液理化性質分析

根據前面的研究，選擇φ為0.75的高內相Pickering乳液對姜黃素進行包載。由于果膠多糖可以在Ca2＋作用下形成網格結構[20]，因此選擇使用0、1、2、4、6 mmol/L 的鈣離子對Pickering乳化層進行交聯，從而強化乳液穩定性。由圖7a可知，負載姜黃素后，乳液油滴變為黃色，隨著鈣離子濃度的增加，外觀變化不明顯。由圖7d可知，油滴D90會隨著鈣離子濃度增加而降低。圖7b為2 mmol/L鈣離子條件下高內相乳液的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像，從中可以清晰分辨乳液的油相和界面層，表明乳液結構比較穩定。光學顯微鏡觀察結果顯示（圖7c），當鈣離子濃度為1～4 mmol/L時，視野中油滴數量較多且分布均勻，當鈣離子濃度達到6 mmol/L時，大量油滴結構發生了坍塌，證明乳液穩定性變差[21-22]，這與鈣離子的過度交聯引發了凝膠收縮失水有關。

高內相乳液的界面組成對其流變行為起到十分關鍵的作用[4,23]。如圖8a所示，不同鈣離子濃度下，4 種乳液的表觀黏度均隨著剪切速率的增大逐漸減小，呈非牛頓流體特征。這與較高的剪切速率下，乳液的網格結構受到破壞，并且依照剪切方向發生了結構重組相關[24]。此外，擬合數據表明，當乳液中加入1 mmol/L Ca2+時，乳液黏度顯著升高，繼續增加Ca2+濃度，乳液黏度發生了一定幅度的下降。

圖8 不同鈣離子濃度下荷載姜黃素Pickering乳液的表觀黏度-剪切速率曲線（a）、應變掃描曲線（b）、頻率掃描曲線（c、d）以及溫度掃描曲線（e、f）Fig.8 Apparent viscosity versus shear rate curves (a),strain sweep curves (b),frequency sweep curves (c,d) and temperature sweep curves (e,f) of curcuminloaded Pickering emulsions with different calcium ion concentrations

如圖8b所示，研究的0.1%～10%應變范圍內，G’和G”均未發生明顯下降，說明4 種乳液的線性黏彈區范圍較大，經過研究，選擇1%的應變進行后續實驗。在頻率掃描實驗中（圖8c），隨著頻率的增加，G’和G”上升明顯，其中G’均顯著高于G”，表明是彈性主導乳液凝膠結構的形成，乳液呈典型的固態彈性特征。隨著鈣離子濃度的升高，姜黃素乳液的黏彈性先升高，在2 mmol/L時達到最大值，達到4 mmol/L時模量反而降低，這與過高的鈣離子造成乳液結構的脫水坍塌有密切關系。另外，由圖8d可知，4 種乳液的tanδ均小于1，并且隨著掃描頻率的增加而增加，說明G”的上升幅度相較于G’更大[25]。

由圖8e可知，在控制應變1%、頻率1.0 Hz條件下，隨著溫度上升而G’和G”顯著下降，這可能與高溫條件下，脂滴之間的相互作用和脂滴吸附層大分子之間的相互作用下降有關。由圖8f可知，而當溫度達到90 ℃并降溫冷卻后，乳液凝膠的黏度迅速上升，黏彈性增強，樣品冷卻到5 ℃時，G’達到了加熱前G’的2～3 倍，這可能與加熱-冷置的循環過程中促進了氫鍵及其他作用力的生成有關，表明加熱-冷置可以用于強化高內相乳液凝膠結構[26]。

2.7 高內相Pickering乳液包封對姜黃素穩定性的影響

如圖9所示，純玉米油中姜黃素的降解較快，在第28天時幾乎檢測不到姜黃素。而使用Pickering乳液包封之后，姜黃素的穩定性顯著提升，在實驗終止時的保留率比純玉米油姜黃素組高10%左右。加入鈣離子交聯后，乳液中姜黃素的穩定性進一步提升，其中2 mmol/L鈣離子濃度下的提升效果最明顯，這可能與鈣離子交聯會使得乳液結構強化，而減少了姜黃素中的泄露和環境中溶解氧、自由基向脂滴中擴散的現象有關[27]。

圖9 玉米油和不同鈣離子交聯Pickering乳液中姜黃素穩定性變化Fig.9 Stability of curcumin dissolved in corn oil and stability of curcuminloaded Pickering emulsions in the presence of 0,1,2,or 4 mmol/L Ca2+

2.8 Pickering乳液中姜黃素的生物轉化率、生物可給率與生物利用度

如圖10a所示，模擬胃腸消化后的Pickering乳液離心后會分為3 層，從上到下分別是油脂層（主要是未消化油脂）、混合膠束層（油脂消化產物、膽汁鹽以及溶解的姜黃素）和沉淀層（未消化樣品、鈣鹽等）[28]。一般認為，在混合膠束層中溶解的姜黃素可以穿過小腸黏液屏障從而被腸上皮細胞吸收利用。由圖10b可知，純玉米油中姜黃素生物轉化率低，僅為30%左右，這與純玉米油對姜黃素的穩定性保護效果不佳有關；消化過程中，pH值的變化和自由基的滲透導致姜黃素大量降解；而在乳液中，姜黃素得到了更好的保護。在生物可給率方面，純油脂在消化液中的分散性較差，導致姜黃素釋放不完全，生物可給率很低，不到50%。然而，在乳液中姜黃素的分散性更好，并且消化產物如游離脂肪酸、2-酰甘油等可以與膽汁鹽形成混合膠束，增強對姜黃素的載運能力[29]。加入了越多鈣離子的乳液，其姜黃素的生物可給率較低。使用鈣離子交聯會降低包封姜黃素的生物可給率，這有可能與以下原因有關：鈣離子的加入會強化乳液結構，導致消化變慢；鈣離子也有可能與游離脂肪酸和膽汁鹽螯合，生成沉淀，從而降低姜黃素在混合膠束層的增溶[30]。總體而言，不同體系中姜黃素生物利用度的順序為：1 mmol/L鈣離子交聯乳液＞2 mmol/L鈣離子交聯乳液＞不含鈣離子乳液＞4 mmol/L鈣離子交聯乳液＞玉米油。

圖10 消化后樣品圖像（a）和姜黃素的生物轉化率、生物可給率和生物利用度（b）Fig.10 Images of the samples after simulated digestion (a) and transformation,bioacessibility,and bioavailability of curcumin dissolved in corn oil and curcumin-loaded Pickering emulsions (b)

3 結論

以牛蒡RG-1型果膠多糖和玉米醇溶蛋白為原料，通過反溶劑法制備了Pickering乳液穩定劑。在穩定劑中果膠多糖質量濃度10 mg/mL、pH 3～5條件下獲得的Pickering乳液乳化層較高且脂滴分布較為均一。隨著NaCl濃度的增加，乳液的粒徑大小降低，但穩定性保持良好。在φ0.17～0.75區間內均能形成穩定的乳液，且在φ0.67和φ0.75條件下形成乳液凝膠。進一步制備了荷載姜黃素的高內相乳液（φ0.75），結果表明，添加鈣離子可以顯著提升荷載乳液的黏彈性以及姜黃素的貯藏穩定性，其中低濃度鈣離子（1、2 mmol/L）的效果會高于高濃度鈣離子（4 mmol/L）。模擬消化實驗發現，使用1、2 mmol/L鈣離子交聯高內相Pickering乳液可以顯著提升姜黃素的生物利用度。本研究對于拓展可食性Pickering乳液在活性因子遞送方面的應用具有積極意義。