乳鐵蛋白、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、高甲酯果膠和β-環糊精四元復合物基高內相Pickering乳液的構建及表征

謝麗清，徐班萌，梁新紅，李 波，楊 偉

（河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003）

高內相Pickering乳液（high internal phase Pickering emulsion，HIPPEs）是內相體積分數大于74%的一類Pickering乳液[1]。與傳統Pickering乳液相比，HIPPEs僅需少量固體或膠體顆粒就能穩定油滴，所形成的乳液體系多為半固態凝膠結構，具有優異的抗聚集、抗絮凝和抗奧氏熟化等特性[2-3]，在食品工業中可作為人造奶油替代物或活性物質運載體系等[4]。

研究發現，與單一顆粒或二元復合物相比，多元復合物穩定Pickering乳液的能力通常更加優異。其中，蛋白質-多酚-多糖三元復合物是目前研究熱點之一。許多三元復合物，如明膠-單寧酸-葡甘聚糖[5]、豌豆蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）-高甲氧基化果膠[6]、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）-姜黃素-燕麥β-葡聚糖[7]和LF-EGCG-低甲酯果膠[8]等，已成功用于穩定Pickering乳液。在這些體系中，蛋白質提供表面活性，多糖通過空間排斥或位阻提供物理穩定性，而多酚一方面作為抗氧化劑為乳液體系提供化學穩定性，同時通過“橋聯”作用與蛋白質和多糖共同構建出更加優異的黏彈性網狀結構，進一步提高了乳液的物理穩定性。因此，推測在蛋白質-多酚-多糖三元復合物顆粒基礎上進一步構建四元復合物顆粒，可能會具有更加優異的乳化穩定能力，但目前仍鮮見相關研究。

β-環糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是由8 個葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵連接的具有閉環結構的低聚糖，具有獨特的疏水空腔，該特性使其能夠包埋小分子，提高小分子的穩定性或水溶性[9]。另外，有研究報道，β-CD能夠穩定Pickering乳液[10]。因此，將β-CD引入蛋白質-多酚-多糖三元復合物體系，可能能夠通過與蛋白質、多酚和多糖之間的相互作用改變復合物的結構，進而形成新的功能特性。目前，有關利用β-CD調控蛋白質-多酚-多糖三元復合物結構和乳化特性的研究尚鮮見報道。

本研究在LF-EGCG-高甲酯果膠（high methoxylated pectin，HMP）三元復合物的基礎上引入β-CD，以進一步調控三元復合物結構。首先，借助多種光譜學技術表征四元復合物結構；然后，制備HIPPEs并研究乳液的微觀結構、流變和質構特性、3D打印特性以及冷藏穩定性；最后，提出四元復合物形成以及其穩定HIPPEs的作用機制。本研究能夠為蛋白質-多酚-雙多糖四元復合物的構建及其在HIPPEs中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LF（純度＞92%）新西蘭New Image國際有限公司；EGCG（純度＞98%）美國Sigma有限公司；β-CD、異硫氰酸熒光素、尼羅紅 上海源葉生物科技有限公司；HMP（甲酯化度72%）安徽喬富企業有限 公司；大豆油 上海益海嘉里食品股份有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ALPHA1-2 LD plus真空凍干機 德國Christ公司；IKA-T25數顯型高速剪切儀 德國艾卡公司；2100N型濁度計 美國Hach公司；Cary Eclipse型熒光分光光度計 美國安捷倫公司；TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；DCAT21型接觸角與表面張力儀 德國DatePhysics公司；Quanta 200型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）美國FEI公司；LSM780型共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laserscanning microscopy，CLSM）德國Zeiss公司；BT-9300H型激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司；Rheolaser Master型光學微流變儀 法國Formulaction 公司；TA.New plus型質構儀 美國ISENSO公司；食品3D打印機 杭州食印科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 三元及四元復合物制備

在10 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，分別配制0.04 g/mL LF、4.0 mmol/L EGCG、0.025 g/mL HMP和0.01 g/mLβ-CD母液，充分溶解后使用。

設置2 個空白對照組：LF-EGCG-HMP三元復合物、LF-EGCG-β-CD三元復合物，分別記為MIX1和MIX2。依據β-CD的不同添加順序，構建得到3 種四元復合物：LFβ-CD-EGCG-HMP、LF-EGCG-β-CD-HMP和LF-EGCGHMP-β-CD，分別記為MIX3、MIX4和MIX5。

配制過程構建嚴格按照添加順序進行：MIX1：1 mL LF＋1.25 mL EGCG＋0.8 mL HMP＋1.95 mL PBS；MIX2：1 mL LF＋1.25 mL EGCG＋0.75 mLβ-CD＋ 2 mL PBS；MIX3：1 mL LF＋0.75 mLβ-CD＋1.25 mL EGCG＋0.8 mL HMP＋1.2 mL PBS；MIX4：1 mL LF＋ 1.25 mL EGCG＋0.75 mLβ-CD＋0.8 mL HMP＋1.2 mL PBS；MIX5：1 mL LF＋1.25 mL EGCG＋0.8 mL HMP＋ 0.75 mLβ-CD＋1.2 mL PBS。每次溶液渦旋（3000 r/min，2 min）混合后，均靜置30 min，以充分自組裝。

1.3.2 濁度測定

分別取20 mL MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5于測試管中進行濁度測定。測定溫度為25 ℃。

1.3.3 熒光光譜測定

分別將MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5稀釋10 倍后進行熒光光譜掃描。激發波長295 nm，激發和發射的狹縫寬度均為10 nm，掃描溫度25 ℃。

1.3.4 紅外光譜測定

將MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5于-18 ℃冷凍48 h，之后冷凍干燥。利用紅外光譜對凍干樣品進行微觀結構觀察。

1.3.5 界面張力測定

使用吊片法分別測定MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5在大豆油中的界面張力[11]。先將20 mL大豆油加入樣品皿中，再將20 mL樣品溶液加入另一樣品皿中測量，最后把20 mL大豆油加入到20 mL樣品溶液中，以PBS作為空白，于25 ℃條件下測定。

1.3.6 接觸角測定

分別將冷凍干燥的MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5壓片，制成直徑13 mm、厚度2 mm的待測樣品。將20 mL大豆油加入樣品皿中，加適量蒸餾水于另一個新的樣品皿中，然后將待測樣品浸入大豆油中，在樣品表面滴2 μL蒸餾水，平衡10 s，記錄并讀取接觸角值。

1.3.7 SEM觀察

將MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5于-18 ℃冷凍48 h，之后冷凍干燥。利用SEM對凍干樣品進行微觀結構觀察。

1.3.8 HIPPEs制備

分別以MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5為液相，大豆油為油相，按油相80%、液相20%比例倒入高腳剪切杯中，使用IKA-T25數顯型高速剪切儀以8000 r/min進行剪切，剪切時間為2 min。制得的HIPPEs分別記為HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5。

1.3.9 CLSM觀察

參考Yusoff等[11]的方法并稍作修改。稱取0.01 g異硫氰酸熒光素和尼羅紅分別溶于異丙醇和無水乙醇，制備0.01%異硫氰酸熒光素染色液和0.01%尼羅紅染色液，分別對LF和大豆油進行染色。之后按照1.3.8節中的方法制備乳液。將乳液置于凹面載玻片上，用蓋玻片覆蓋，并在蓋玻片周圍涂上甘油密封。分別在514、488 nm波長下激發異硫氰酸熒光素和尼羅紅熒光，記錄乳液微觀形貌。

1.3.10 粒徑和粒徑分布測定

分別取適量HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于激光粒度分布儀的攪拌裝置中，與蒸餾水充分混合，在透光率15%時，進行粒徑及其分布測定。

1.3.11 光學微流變測定

將HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5分別裝入平底圓柱玻璃管（高度70 mm，外徑27.5 mm），靜置4 h 后進行微流變分析。記錄乳液的彈性因子（elasticity index，EI）、宏觀黏度因子（macroscopic viscosity index，MVI）和固液平衡值（solid-liquid balance，SLB）。

1.3.12 質構特性測定

分別取5 mL HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5置于小燒杯中進行質構分析，測定其硬度、黏性、內聚力、膠著性和咀嚼性。探頭為P0.5，模式為TPA，測試前后速率均為2 mm/s，測試速率為1 mm/s，壓縮距離為4 mm。

1.3.13 3D打印特性測定

選擇直徑30 mm，高15 mm圓柱體作為3D打印模型，采用1.2 mm口徑針頭進行3D打印。3D打印參數設置如下：移動速率30 mm/s，回縮速率40 mm/s，填充速率20 mm/s，填充密度80%，溫度25 ℃。樣品成型后使用游標卡尺測量圓柱體底部直徑。

1.3.14 抗氧化能力測定

1.3.14.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除能力測定

參考朱穎等[12]的方法，并稍作修改。稱取3.94 mg DPPH，加入適量無水乙醇溶解，避光超聲10 min后，用無水乙醇定容至100 mL，得到100 μmol/L的DPPH自由基溶液，避光保存備用。分別將HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5用蒸餾水稀釋10 倍，渦旋2 min。對照組為2 mL 100 μmol/L DPPH自由基溶液＋2 mL無水乙醇，空白組為2 mL待測樣品＋2 mL無水乙醇，實驗組為2 mL待測樣品＋2 mL 100 μmol/L DPPH自由基溶液。各組室溫避光反應30 min后，于517 nm波長處測定吸光度。按式（1）計算DPPH自由基清除率：

式中：A為實驗組吸光度；A0為空白組吸光度；A1為對照組吸光度。

1.3.14.2 2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力測定

參考朱穎等[12]的方法，并稍作修改。稱取ABTS 0.0960 g、過硫酸鉀0.0331 g溶于50 mL蒸餾水中，避光靜置12 h，作為ABTS陽離子自由基母液。使用無水乙醇稀釋母液至其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02，用作ABTS陽離子自由基待測液。分別將HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5用蒸餾水稀釋10 倍作為待測樣品?？瞻捉M為3.6 mL ABTS陽離子自由基溶液＋0.4 mL無水乙醇，實驗組為3.6 mL ABTS陽離子自由基溶液＋0.4 mL待測樣品。各組室溫避光反應5 min，于734 nm波長處測定吸光度。按式（2）計算ABTS陽離子自由基清除率：

式中：A為空白組吸光度；A0為實驗組吸光度。

1.3.15 乳液穩定性測定

乳析指數：分別取5 mL HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于10 mL離心管中，8000 r/min 離心20 min，測定離心后析出層與乳液高度。按式（3）計算乳析指數：

貯藏穩定性：分別取適量HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于玻璃瓶中，常溫放置1、3、5、7 d后觀察樣品表觀變化。

冷藏穩定性：分別取適量HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于玻璃瓶中，4 ℃冷藏1、3、5、7 d后，常溫放置20 min，觀察樣品表觀變化。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 三元及四元復合物的結構特性

由圖1A可知，MIX1的濁度高達2637 NTU。這與之前的研究類似，這是因為HMP帶負電荷，能夠與 LF-EGCG復合物通過靜電復合物形成高濁度凝聚體[13]。隨著β-CD添加，形成的四元復合物濁度進一步增加，表明復合物中分子間的聚集行為增強。當β-CD質量濃度達到0.0015 g/mL后，進一步增加其質量濃度，溶液濁度不再增加，表明此時β-CD對溶液體系的影響達到飽和。在0.0015 g/mLβ-CD條件下，MIX2的濁度僅為15 NTU，溶液清澈透明。這也與之前的研究類似，認為β-CD作為中性電荷，不能與LF通過靜電相互作用，但能夠通過其疏水空腔結合EGCG，競爭性干擾LF與EGCG的相互作 用[14]。另外，自組裝順序直接影響了加入β-CD后的四元復合物濁度，從高到低依次為MIX3＞MIX4＞MIX5。

圖1 三元及四元復合物的濁度（A）、熒光特性（B）、紅外 光譜（C）、油-水界面張力（D）、接觸角（E）和SEM圖像（F）Fig.1 Turbidity (A),fluorescence spectra (B),FTIR spectra (C),oilwater interfacial tension (D),contact angle (E) and SEM images (F) of the ternary and quaternary complexes

由圖1B可知，相較于MIX2，MIX1的熒光強度較強，表明研究所用濃度條件下，相比于β-CD，HMP對LF與EGCG相互作用的干擾能力更強，進而減弱EGCG對LF的熒光淬滅效應。與MIX1相比，四元復合物的熒光強度增強，表明β-CD的添加進一步減弱了EGCG對LF的熒光猝滅效應。這可歸因于β-CD所具有的空腔結構，能夠通過氫鍵包埋EGCG。

在蛋白質紅外光譜中，位于3400 cm-1附近的酰胺A帶與N—H伸縮振動有關，當其與氫鍵締合時，將向低波數位移[15]。由圖1C可知，MIX1和MIX2的酰胺A帶分別位于3365.1 cm-1和3355.9 cm-1處，而在MIX3、MIX4和MIX5中分別紅移至3332.1、3305.9 cm-1和3307.7 cm-1。蛋白質的酰胺I帶位于1600～1700 cm-1之間，歸因于多肽骨架的C＝O伸縮振動，其變化也與氫鍵的形成密切相關[16]。與MIX1和MIX2相比，MIX3、MIX4和MIX5中的酰胺I帶出現明顯藍移。顯然，氫鍵參與了四元復合物的形成。另外，在1057～1077 cm-1區域峰的位移進一步表明四元復合物中各物質之間發生了相互作用。

界面張力的降低有利于乳化穩定[17]。由圖1D可知，與三元復合物相比，四元復合物的界面張力降低約3 mN/m，表明添加β-CD后，復合物更易于吸附在乳滴表面，表現出更強的乳化穩定性。MIX3界面張力最低，說明其乳化穩定性最強。在四元復合物中，LF、EGCG和β-CD均具有穩定HIPPEs的能力，因此，它們之間的相互作用可能是四元復合物乳化穩定性提高的原因。

接觸角是衡量顆粒潤濕性的重要指標。通常，接觸角小于90°時，表明顆粒具有較強的潤濕水能力，形成的Pickering乳液多為O/W型；反之，接觸角大于90°時，表明顆粒具有較強的潤濕油能力強，形成的乳液多為W/O型。另外，接觸角越接近90°時，形成的乳液越穩定[18]。由圖1E可知，三元復合物和四元復合物的接觸角之間差異明顯，從高到低為：MIX3（89.9±0.2）°＞ MIX4（85.8±0.2）°＞MIX5（79.5±0.2）°＞MIX2（76.2±0.2）°＞MIX1（74.6±0.1）°，這表明相比于三元復合物，四元復合物更易穩定HIPPEs。特別是MIX3，其接觸角接近90°，顯著高于MIX1和MIX2，這直接說明了自組裝順序的重要意義。即自組裝順序通過靈活調控四元復合物的結構和顆粒潤濕性，顯著影響著它們穩定HIPPEs的能力。這與之前強調自組裝順序對于LF-EGCG-低甲酯果膠三元復合物結構和乳化特性影響的研究結果[8]一致。

由圖1F可知，MIX1表現出典型的網絡交聯結構，這與其含有HMP密切相關。HMP能夠通過氫鍵、疏水相互作用和范德華力等非共價作用力與LF和EGCG分別或共同相互作用，進而形成復雜的網絡結構。相比而言，MIX3、MIX4和MIX5的網絡交聯行為更加明顯，結構更加致密。此外，MIX2的顆粒形貌幾乎無網絡結構，這是因為β-CD并不具備HMP的結構特點，其所形成的 “—(LF-EGCG-β-CD)n—”結構不具備相互交聯特性。

綜上，β-CD的添加顯著影響了LF-EGCG-HMP三元復合物的結構，所形成的四元復合物可能會不同程度地影響HIPPEs的結構和穩定性。

2.2 CLSM分析

如圖2所示，三元復合物和四元復合物用異硫氰酸熒光素染色，呈綠色；大豆油用尼羅紅染色，呈紅色。三元復合物和四元復合物（綠色）均吸附在乳液界面，并緊密包裹著乳滴（紅色）。顯然，這些乳液均為O/W體系。同時，連續相呈綠色，說明存在大量游離的（未吸附的）三元復合物和四元復合物。它們能夠通過空間位阻作用抑制乳滴的聚結，有利于HIPPEs的穩定。另外，乳滴均呈非球形，表明這些乳液由Pickering穩定機制穩定，乳滴間存在強烈的擠壓形變行為。

圖2 三元及四元復合物的粒徑分布及CLSM圖Fig.2 Particle size distribution and CLSM images of the ternary and quaternary complexes

由表1可知，在這些HIPPEs中，乳滴的粒徑大小和均一度存在一定差異。HIPPE1的D50、D4,3、D3,2分別為（23.24±0.17）、（26.24±0.12）、（9.18±0.13）μm，HIPPE 2 的D50、D4,3、D3,2分別為（26.99±0.61）、（38.87±0.30）、（12.32±0.61）μm，均一性較差。相比而言，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5中的D50、D4,3、D3,2分別在17～20、19～24、7～10 μm范圍內，乳滴粒徑明顯減小，分布趨于均一?；谒脑獜秃衔锏膹碗s網絡結構以及優異的顆粒潤濕性（接觸角更接近90°），推測四元復合物通過兩方面提高HIPPEs穩定性：1）更緊密吸附于油水界面；2）在連續相中形成高黏度網狀結構，通過強大的空間位阻作用和高黏度有效抑制乳滴之間的聚集。

表1 三元及四元復合物的粒徑Table 1 Particle sizes of the ternary and quaternary complexes

2.3 光學微流變分析

相比于機械流變，以多散斑擴散波光譜學為理論基礎的光學微流變可以在無干擾條件下準確反映軟物質體系（如懸浮液、乳液、水凝膠和泡沫等）的流變性質，目前已成為一種重要的流變學研究手段[19]。

EI值表征乳液的彈性，其大小與體系中網絡結構的強度密切相關。EI值越大，乳液中網絡結構越致密，體系越穩定；反之，乳液中網絡結構越松散，體系越不穩定，易發生形變[20]。由圖3可知，與HIPPE1和HIPPE2相比，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的EI增大，特別是HIPPE3，EI值達（4.4±0.1）×10-3nm-2，是HIPPE1和HIPPE2的1.64 倍和1.88 倍。這表明HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的連續相中形成了更加致密的網絡結構，可歸因于MIX3、MIX4和MIX5致密的網絡結構。

MVI值表征乳液的黏性，值越大表示體系中液滴的運動阻力越強，體系越穩定[21]。由圖3可知，與HIPPE1、HIPPE2相比，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5具有更高的MVI值。這說明在HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5中，乳液液滴的運動速度變慢，乳液變得更加穩定。顯然，β-CD的添加增強了乳液連續相中三元復合物的黏度。

SLB值表征乳液的固液特征。通常，0＜SLB＜0.5時，體系傾向于固體行為；0.5＜SLB＜1.0時，體系傾向于液體行為；SLB＝0.5時，體系達到固液平衡[22]。由圖3可知，HIPPE1的SLB值為0.50±0.001，說明HIPPE1 為固液平衡體系，HIPPE2 的SLB 值為0.57±0.0025，大于0.5，說明HIPPE2體系更傾向于液體。相比而言，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的SLB值減小，分別為0.45±0.001、0.46±0.001和0.47±0.001，說明β-CD的加入使HIPPE1由固液平衡體系向類固體體系轉變。乳液的類固體行為較液體行為和固液平衡更有利于防止乳液體系的聚結和奧氏熟化[23]。

2.4 質構特性和3D打印特性

由表2可知，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5在硬度、黏性、內聚力、膠著性、咀嚼性指標上均優于HIPPE1和HIPPE2，這可歸因于HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的致密網絡結構和高黏性[24]。

表2 三元及四元復合物的質構特性Table 2 Texture characteristics of the ternary and quaternary complexes

3D打印技術因其快速成型、個性化定制等優點，特別適合用于食品新結構的開發和應用[25]。圖4A為HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的3D打印成型效果圖。通過對3D打印乳液底部直徑的測定，可間接反應乳液的3D打印穩定性。初始3D打印HIPPEs為直徑30 mm、高15 mm的圓柱體。但放置12 h后，HIPPE1和HIPPE2出現較為嚴重的坍塌，由圖4B可知，乳液底部直徑分別達到40.1 mm和41.0 mm。相比而言，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5底部直徑介于35.3～38.8 mm之間。這說明四元復合物基HIPPEs的支撐性能更強，表現出更加優異的3D打印特性，特別適合作為食品3D打印材料。顯然，這應歸因于HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的優異黏彈性和質構特性。

圖4 三元及四元復合物的表觀形貌（A）和3D打印直徑（B）Fig.4 Visual appearance (A) and 3D printed diameters (B) of the ternary and quaternary complexes

2.5 抗氧化能力分析

之前報道發現，與單一多酚和蛋白質-多酚二元復合物相比，一些蛋白質-多酚-多糖三元復合物的抗氧化性較低，這種現象被歸因于復合物中多糖對多酚“束縛”[26-27]。然而，本研究發現，與三元復合物基乳液相比，四元復合物基乳液的抗氧化性增強。由圖5可知，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的DPPH自由基清除能力分別為82.3%、76.6%和73.3%，高于HIPPE1（41.5%）和HIPPE2（45.7%）；ABTS陽離子自由基清除能力分別為54.2%、51.2%和48.5%，高于HIPPE1（40.3%）和HIPPE2（42.3%）。由于EGCG是發揮抗氧化性的主要因素，因此推測四元復合物基HIPPEs抗氧化性提高的原因是：β-CD通過氫鍵作用與EGCG結合，競爭性降低HMP對EGCG的“束縛”，通過形成相對松散的“—(β-CDEGCG-HMP)n—”結構，增加EGCG的水溶性，進而提高整個乳液體系的抗氧化能力。不過，該推測仍需進一步研究加以驗證。

圖5 三元及四元復合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力Fig.5 DPPH and ABTS cation radical scavenging activities of the ternary and quaternary complexes

2.6 乳液穩定性分析

乳析指數可以用于評價乳液的物理穩定性，其值越高，乳液物理穩定性越差，反之則越強[28]。由圖6A可知，HIPPE2在離心后表現出明顯的破乳現象（大量油析出），說明LF-EGCG-β-CD三元復合物的乳化穩定性較差。HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的乳析指數低于HIPPE2，說明它們的離心穩定性增強。HIPPE3的乳析指數最小，這可歸因于HIPPE3較小的粒徑、較致密的結構和較高的黏彈性。

圖6 三元及四元復合物的乳析指數（A）、常溫穩定性（B）和 冷藏穩定性（C）Fig.6 Creaming index (A),room temperature stability (B) and refrigeration stability (C) of the ternary and quaternary complexes

由圖6B、C可知，5 種乳液均表現出良好的常溫穩定性，但其冷藏穩定性卻不相同：HIPPE1、HIPPE2出現了可見的析油現象，而在HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5中并未發生。這說明HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5具有良好的冷藏穩定性，適合在冷藏食品體系應用。

2.7 四元復合物及其HIPPEs可能的形成機制

如圖7所示，在MIX3中，首先形成LF-β-CD二元混合物（LF與β-CD相互作用力弱）；添加EGCG后，形成濁度較低的LF-β-CD-EGCG三元復合物；之后，借助于與LF和EGCG的相互作用，HMP將LF-β-CD-EGCG三元復合物吸附于表面，促進了各成分之間的交聯，形成了結構復雜的網絡結構。MIX4的結構形成過程與MIX3類似，區別在于大量LF-EGCG-β-CD三元復合物存在于該結構內部，部分“掩蓋”了復合物整體的乳化能力。MIX5的網絡結構相對簡單，主要是由LF-EGCG-HMP三元復合物及圍繞在該復合物表面的β-CD組成?？傊?，β-CD的加入推動了復合物中各成分的重組裝，優化了顆粒網絡結構，使其具備更加適宜的潤濕性。當MIX3、MIX4和MIX5作為連續相穩定HIPPEs時，這些顆粒通過強界面吸附能力及高黏網絡結構，賦予HIPPEs優異的黏彈特性和穩定性。

圖7 四元復合物可能的形成（A）及其穩定HIPPEs的 作用機制（B）示意圖Fig.7 Schematic diagrams of the possible mechanisms involved in the formation of the quaternary complexes (A) and the structures of HIPPEs (B)

3 結論

與三元復合物相比，由LF、EGCG、HMP和β-CD自組裝構建的四元復合物具有較低的界面張力和更加適宜的潤濕性，表現出優異的穩定HIPPEs特性。四元復合物的致密交聯網絡賦予HIPPEs更高的黏彈性、質構特性和3D打印特性。同時，β-CD能夠通過干擾EGCG與LF或HMP的結合，顯著提高HIPPEs的抗氧化特性。另外，自組裝順序靈活調控著四元復合物的結構和乳化特性。本研究為蛋白質-多酚-雙多糖四元復合物的構建及其在HIPPEs中的應用提供理論依據。