發酵豆制品理化性質與微生物群落對生物胺形成的影響

羅 璇，程 成，張 琦，王允圃，宋蕭蕭，解鴻蕾，劉玉環，崔 憲,

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；3.哈爾濱市疾病預防控制中心，黑龍江 哈爾濱 150000）

生物胺是一類具有生物活性、含氮堿性低分子質量有機化合物的總稱。其廣泛分布于動植物及食品中，尤其在發酵食品中含量較高。生物胺具有“低促高毒”的特點，適量攝入能夠起到促進生長、增強代謝活力、清除自由基等作用，而過量攝入則會導致人體中毒等不良反應。有研究表明，食品中的組胺、酪胺和苯乙胺分別超過100、100 mg/kg和30 mg/kg會造成人體中毒[1]。此外，尸胺、腐胺等二胺還能夠與亞硝酸鹽反應生成亞硝胺等雜環類致癌物質。因此，考慮到生物胺對于人體的危害，Taylor等[2]建議把生物胺總量作為衡量食品安全的重要指標。目前，我國僅針對部分食品（如魚類、酒類等）中生物胺含量制定了相關標準，而傳統發酵食品中生物胺的限量問題并未引起足夠重視。我國傳統發酵豆制品主要分為固態類發酵豆制品（豆豉、腐乳等）與液態類發酵豆制品（醬油等），因其風味獨特、營養價值高等特點在日常生活中被廣泛食用，其中生物胺的含量也逐漸受到關注。Gong Xiao等[3]研究發現豆豉中存在大量腐胺（108.9 mg/kg）、尸胺（121.4 mg/kg）、組胺（202.4 mg/kg）、酪胺（94.1 mg/kg）等。Jeon等[4]在韓國傳統豆類發酵食品清國醬中發現β-苯乙胺、組胺和酪胺含量分別超過了推薦的毒性限度的19、4 倍和3 倍。因此，研究發酵豆制品中生物胺含量對保障其食品安全具有重要意義。

發酵食品中微生物代謝產生的生物胺的種類和含量受到多種因素的影響。Guan Rongfa等[5]報道，黃酒中的白蘇和紅蘇含量直接影響生物胺產生菌的數量。Fong等[6]研究表明，腌肉、發酵魚、醬菜等發酵制品中較高的氨基酸含量能夠增加生物胺含量和積累程度。Zaman等[7]發現Bacillus amyyloliquefaciens和Staphylococcus carnosus的分離株能夠減少魚露發酵過程中組胺的積累程度。目前，多數研究集中于發酵豆制品發酵過程以及貯藏過程中生物胺含量的監測[8]，針對發酵豆制品中生物胺含量與原料理化性質、微生物群落的相關性分析鮮有報道。

本研究以7 種液態類發酵豆制品和7 種固態類發酵產品為研究對象，對8 種常見生物胺含量、理化性質、微生物群落進行檢測，并通過Pearson相關性、結構方程模型、冗余分析等統計學方法進行相關性分析，以探究發酵豆制品中生物胺的產生機制，為完善發酵豆制品的標準法規提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從江西南昌某超市購買的14 種保質期內發酵豆制品作為實驗材料，分為4 類產品，如表1所示。

表1 實驗樣品信息Table 1 Sample information

組胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、腐胺鹽酸鹽（純度 均≥99%），色胺鹽酸鹽、亞精胺鹽酸鹽標準品（純度均≥98%），1,7-二氨基庚烷內標標準品（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；β-苯乙胺鹽酸鹽、尸胺鹽酸鹽標準品（純度≥98%）上海麥克林生化科技有限公司；精胺鹽酸鹽標準品（純度≥98%）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

K9860型全自動凱氏定氮儀 山東海能科學儀器有限公司；PHS-3G型pH計 梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；HD-4型智能水分活度測試儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀 安捷倫科技（德國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標檢測

pH值測定根據GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[9]；總酸及氨基酸態氮測定根據GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》[10]；食鹽含量測定根據 GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》[11]，采用直接沉淀滴定法；水分活度測定根據GB 5009.238—2016《食品水分活度的測定》[12]，采用水分活度儀擴散法測定；凱氏氮測定利用K9860全自動凱氏定氮儀進行測定。上述指標取樣平行測定3 次。

1.3.2 生物胺含量檢測1.3.2.1 標準曲線的建立分別取100 m g/L 生物胺標準混合使用液，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋，配制成質量濃度為2.0、3.0、4.0、5.0、12.0、20.0、40.0 mg/L的生物胺標準系列溶液，臨用現配。

1.3.2.2 色譜條件及標準曲線建立

參考GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》[13]。采用HPX-87 C18色譜柱（300 mm×7.8 mm），紫外檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。流動相A為90%乙腈、10%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為10%乙腈、90%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序如表2所示。

表2 衍生后樣品的分離洗脫梯度Table 2 Gradient elution program

1.3.3 樣品預處理

醬油樣品與固態發酵豆制品的預處理分別參考Qi Qi[14]和Hu Min[15]等，處理后樣品按1.3.2.2節色譜條件進行進樣分析。

1.3.4 微生物群落多樣性分析

樣品由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S rDNA高通量測序，并在美吉生信云平臺進行分析。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 繪圖及單因素方差分析、Pearson相關性分析

使用Origin 2022軟件進行數據處理并繪圖。使用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析、Pearson相關性分析。P＜0.05，差異顯著。

1.4.2 結構方程模型

使用SPSS AMOS軟件進行結構方程模型分析[16]，其路徑方程如式（1）、（2）所示：

式中：p為內生變量個數；q為外生變量個數；yi為p×1觀察到內生變量個數的向量；xi為q×1觀察到外生變量個數的向量；α為p×1回歸方程截距的向量；B為p×p回歸方程斜率的矩陣；Γ為p×q回歸方程斜率的矩陣；ζi為p×1干擾因素即殘差的向量；Ψ為p×p干擾因素的協變量矩陣。

根據目前已有的研究結果，氨基酸態氮含量與體系的鹽度、pH值具有一定關系，生物胺總量受到鹽度、pH值、總酸、水分活度、氨基酸態氮以及凱氏氮等指標的影響[3,6,8]。因此，該模型下的兩條路徑模型構建為：1）pH值和鹽度對氨基酸態氮的影響；2）鹽度、pH值、總酸、水分活度、氨基酸態氮以及凱氏氮對生物胺總量的影響。根據上述條件，利用結構方程模型對生物胺及各類理化指標之間的關系進行分析。

2 結果與分析

2.1 生物胺含量分析

取生物胺標準混合使用液，根據上述色譜條件進行分析，重復測定3 次，得到8 種生物胺的出峰時間及標準品色譜圖，如圖1a所示。以生物胺質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標得到線性回歸方程，其線性范圍內相關系數（R2）均大于0.99，表明8 種生物胺質量濃度與峰面積之間存在良好線性關系。液體類代表性樣品黑豆老抽（1-1）色譜圖如圖1b所示，固體類樣品豆豉（2-4）色譜圖如圖1c所示。

圖1 生物胺標準品與代表性樣品的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of biogenic amine standards and representative samples

如表3、4所示，不同發酵豆制品的生物胺含量存在一定差異，但所有樣品中均能檢出組胺。色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺質量濃度和生物胺總量在14 種樣品中范圍分別是0～1274、0～1867、0～7908、0～715、15.3～2637、0～947、0～115、0～498、112～11209 mg/L。

表3 液體發酵豆制品中生物胺含量Table 3 Biogenic amine contents in fermented liquid soybean productsmg/L

在液態類產品中8 種生物胺均能檢出，但因制作工藝不同，不同樣品的生物胺總量存在差異。老抽類和生抽類醬油（1-1～1-4）中生物胺總量低于250 mg/L，各類生物胺含量均低于限制值，在生物胺安全方面表現良好。在同類型產品中，黑豆類醬油（1-1、1-3）生物胺含量明顯高于黃豆類醬油（1-2、1-4），可能是由于黑豆中蛋白質含量較高，為生物胺產生菌提供了更多可利用底物[17]。脫脂大豆醬油（1-5）、蒸魚豉油（1-6）、牡蠣減鹽醬油（1-7）中生物胺總量分別為11209.7、10266.7、8262.5 mg/L，并顯著高于其他樣品（P＜0.05），遠超過1000 mg/kg的限量標準，對人體健康具有負面影響[18]。其中，脫脂大豆醬油（1-5）樣品中腐胺含量最高，達到7908 mg/L；蒸魚豉油（1-6）樣品中組胺含量最高，達到2637 mg/L；牡蠣減鹽醬油（1-7）中樣品苯乙胺含量最高，達到1867 mg/L。近年來，已開展了市售醬油中生物胺含量的相關研究。于金芝等[19]報道表明，市售醬油中生物胺總量范圍為102.87～760.28 mg/kg，以酪胺、組胺為主。陸永梅[20]對市售醬油生物胺含量進行分析，結果表明酪胺、組胺、尸胺、亞精胺、精胺含量分別為0～672.7 mg/kg、0～591.9 mg/kg、0～550.3 mg/L、0～485.9 mg/L、0～145.2 mg/L。曹忠娜[21]發現，部分市售醬油中的生物胺總量已超出美國食品藥品監督管理局建議食品中生物胺總量不大于1000 mg/L的標準。由此可見，目前部分市售醬油類產品中的生物胺含量存在潛在健康安全風險，有必要研究影響其中生物胺形成的因素。

如表4所示，檢測的固態類產品生物胺總量均低于1000 mg/kg。相比于豆腐乳類產品（2-1～2-3），豆豉類產品（2-4～2-6）生物胺總量較高。在豆豉（2-4）中8 種生物胺均有檢出，生物胺總量達到867.3 mg/L，以組胺（459.0 mg/kg）和酪胺（220.0 mg/kg）為主。根據Gong Xiao等[3]的研究，豆豉樣品中存在著大量腐胺、尸胺和組胺。這可能是由于豆豉在發酵過程中產生大量氨基酸，為生物胺的生成提供了更多前體物質，在氨基酸脫羧酶的作用下，氨基酸脫羧生成生物胺[8,22]。雖然非傳統發酵豆制品巧克力（2-7）生物胺總量（412.6 mg/kg）相比于豆豉類產品較低，但其組胺含量高達338.0 mg/kg，超過了100 mg/kg限定值[2]，也存在一定潛在安全風險。

表4 固體發酵豆制品中生物胺含量Table 4 Biogenic amine contents in fermented solid soybean productsmg/kg

2.2 生物胺含量與理化指標的相關性分析

如表5 所示，14 種樣品的pH 值、水分活度、鹽度、氨基酸態氮、總酸、凱氏氮含量分別為4.83～6.83、0.653～0.999、0.29～37.92 g/100 g、0.52～1.28 g/100 g、10.82～83.67 g/kg、1.31%～6.04%。在液態類產品中，醬油類產品1-5～1-7 總酸含量顯著高于1-1～1-4 樣品（P＜0.05），其他指標無明顯差異。同時，醬油類產品1-5～1-7生物胺總量顯著高于1-1～1-4樣品（P＜0.05）（表3）。固態類產品中，豆豉類產品（2-4、2-5）的總酸含量顯著高于其他樣品（P＜0.05），鹽度顯著低于大部分其他樣品（P＜0.05）。同時，豆豉類產品（2-4、2-5）的生物胺總量高于大部分固體（表3、4）。此外，巧克力的鹽度顯著低于醬油類產品及豆腐乳類產品（P＜0.05）。而具有較低鹽度的巧克力生物胺總量也顯著低于1-5～1-7樣品（P＜0.05）（表3、4）。

表5 不同發酵豆制品理化性質Table 5 Physicochemical properties of different fermented soybean products

如圖2所示，水分活度、總酸、鹽度和氨基酸態氮與大部分生物胺含量呈正相關，而pH值和凱氏氮與大部分生物胺含量呈負相關。總酸和水分活度與亞精胺的生成呈顯著正相關。較高的水分活度可能促進產胺微生物生長繁殖，導致生物胺積累[23]。李東蕊等[24]的研究表明，環境因素如pH值與總生物胺、腐胺呈高度相關，而其他環境因素如NaCl濃度、總酸、含水量和氨基酸態氮則對亞精胺的生成有一定積極影響，這與本研究結果一致。總酸在生物胺的生成過程中起到重要作用，這是由于微生物通過脫羧作用產生堿性生物胺提高細胞內外的pH值抵御酸性環境[25]。因此，如表5所示，本研究中14 個樣品均呈輕微酸性，符合微生物產生生物胺的pH值條件[6]。通常，總酸含量越高，pH值越低，越有利于生物胺的產生。當pH值較低時，對微生物的脫羧作用促進越明顯[25]，因此pH值與大部分生物胺含量呈負相關。凱氏氮含量越高，其中氨氮含量也越高，可能會對pH值的上升具有促進作用，從而不利于生物胺產生。此外，高濃度NaCl會使食品體系的滲透壓升高，從而影響微生物的生長和氨基酸脫羧酶的活性。Qi Qi等[26]研究發現耐鹽性酵母Zygosaccharomyces rouxii和Candida versatilis在含17% NaCl的高鹽環境下能產生大量的生物胺。然而，高濃度的NaCl也可能導致某些嗜鹽微生物的氨基酸脫羧酶活性下降。Chander等[27]通過研究不同鹽含量（0%～6%）對Lactobacillus bulgaricus產生物胺能力的影響，發現較高含量的NaCl對該種微生物產胺能力有一定抑制作用。綜上所述，食品中微生物的生理活動與生物胺的產生和積累具有密切聯系。

圖2 生物胺與理化指標的相關性熱圖Fig.2 Heatmap of the correlation between biogenic amines and physicochemical indices

如圖3所示，近似均方根誤差（the root mean square error of approximation，RMSE）為0.00，表明為最佳擬合。pH值（因子載荷-0.616）、凱氏氮（因子載荷-0.343）對生物胺的產生具有負面效應；水分活度（因子載荷0.413）、鹽度（因子載荷0.330）和總酸（因子載荷0.399）對生物胺的產生具有正面效應。相關性分析表明水分活度、總酸、鹽度和氨基酸態氮與大部分生物胺含量呈正相關（圖2）。結構方程模型分析的結果進一步驗證了本研究中發酵豆制品的水分活度、總酸、鹽度與生物胺含量呈正相關。

圖3 6 種環境因素影響生物胺總量的結構方程模型Fig.3 Structural equation modeling of six environmental factors affecting the total amount of biogenic amines

2.3 生物胺含量與微生物群落的相關性分析

選取具有代表性的6 種樣品：黑豆老抽（1-1）、黃豆老抽（1-2）、脫脂大豆醬油（1-5）、豆豉（2-4）、納豆（2-5）、水豆豉（2-6）進行微生物群落分析，如 圖4所示。

圖4 6 種樣品屬水平微生物群落相對豐度Fig.4 Relative abundance of microbial communities in six samples at the genus level

圖5 6 種樣品微生物屬水平群落熱圖Fig.5 Heatmap of the microbial communities in six samples at the genus level

體系中微生物群落組成在一定程度上影響著生物胺種類與含量。如圖4、5所示，假單胞菌屬是黑豆老抽醬油（1-1）、黃豆老抽醬油（1-2）、脫脂大豆醬油（1-5）樣品中的優勢菌屬，芽孢桿菌屬是豆豉（2-4）、納豆（2-5）、水豆豉（2-6）的優勢菌屬。研究表明，假單胞菌能夠分泌熱穩定的脂肪酶水解乳脂，釋放游離脂肪酸增加總酸含量，從而促進生物胺的產生和積累[28]。除此之外，假單胞菌還具有產生腐胺、酪胺、尸胺的能力[29]。這可能是脫脂大豆醬油（1-5）的生物胺含量顯著高于其他樣品（P＜0.05）的原因。芽孢桿菌產生的細菌素已被證明能夠抑制產胺菌的活性[30]。因此，在芽孢桿菌的抑制作用下，樣品豆豉（2-4）、納豆（2-5）、水豆豉（2-6）中生物胺總量顯著低于樣品脫脂大豆醬油（1-5）（P＜0.05）。此外，糞腸球菌具有合成酪胺的能力[18]，其在水豆豉（2-6）中的相對豐度較高，水豆豉（2-6）中酪胺占總生物胺含量比例也最高（35.90%）（表3）。

此外，有研究表明，生物胺的形成還受到基質和環境條件的影響[18]。為進一步探究微生物與理化指標、生物胺含量之間的關系，對上述樣品的生物胺含量以及微生物相對豐度進行相關性分析，如圖6所示。對這些樣品的生物胺含量、理化性質以及微生物相對豐度進行冗余分析，如圖7所示。

圖6 6 種樣品生物胺含量與微生物相對豐度相關熱圖Fig.6 Heatmap of the correlation between biogenic amine contents and relative abundance of microbial communities in six samples

圖7 6 種樣品微生物菌屬與基礎理化指標冗余分析結果Fig.7 Redundancy analysis of microbial genera versus basic physicochemical indices in six samples

如圖6所示，假單胞菌屬、代爾夫特菌屬、產堿桿菌屬、水桿菌屬與生物胺總量、精胺、亞精胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺的產生呈正相關。而芽孢桿菌屬與7 種生物胺含量及生物胺總量呈負相關，四聯球菌屬、腸球菌屬、片球菌屬與生物胺總量呈負相關。如圖7所示，納豆（2-5）、豆豉（2-4）、水豆豉（2-6）3 種固體樣品的凱氏氮含量、總酸含量與芽孢桿菌屬的相對豐度呈正相關。這可能是由于芽孢桿菌屬更適合在總酸含量較高的條件下生長，這與鄒俊杰等[31]的研究結果一致。而黃豆老抽醬油、黑豆老抽醬油、脫脂大豆醬油的假單胞菌屬相對豐度與鹽度和氨基酸態氮呈正相關。其中黑豆老抽（1-1）、黃豆老抽（1-2）、脫脂大豆醬油（1-5）中假單胞菌屬的相對豐度最高（圖4），其鹽度范圍為29.41～31.10 g/100 g（表5）。谷新晰等[32]也證明假單胞菌屬受氨基酸態氮的影響較顯著（0.001＜P≤0.01）。生物胺總量與假單胞菌屬相對豐度呈正相關，與芽孢桿菌屬、四聯球菌屬相對豐度呈負相關，這與相關性分析結果一致。

綜上所述，假單胞菌屬可能是因為增加了體系中脂肪酸含量進而促進了生物胺的累積，而芽孢桿菌屬則可能是因為產生細菌素抑制產胺菌活性進而抑制了生物胺的產生。此外，總酸含量較高的條件能促進芽孢桿菌屬生長，較高的鹽度（29.41～30.90 g/100 g）和氨基酸態氮能夠促進假單胞菌屬的生長。樣品的理化性質通過影響微生物的生理活動從而最終影響食品中生物胺的水平。因此，理化性質和微生物群落均對生物胺生成具有一定影響。為進一步保障發酵豆制品潛在健康安全風險，建議控制發酵豆制品的制作工藝與發酵菌種等。

3 結論

以7 種液態發酵豆制品和7 種固態發酵豆制品為研究對象，對8 種常見生物胺含量、微生物群落多樣性以及相關理化指標進行測定。脫脂大豆醬油、蒸魚豉油、牡蠣減鹽醬油中的生物胺總量分別為11209.7、10266.7、8262.5 mg/L，顯著高于其他樣品（P＜0.05）。大部分液體樣品中生物胺含量高于固體。樣品中pH值和凱氏氮含量與生物胺總量呈負相關，水分活度（因子載荷0.413）、總酸含量（因子載荷0.399）和鹽度（因子載荷0.330）對生物胺總量的正面效應最大，對生物胺的產生和積累起到積極作用。假單胞菌是黑豆老抽、黃豆老抽、脫脂大豆醬油中的優勢菌種，與發酵豆制品中生物胺含量呈正相關。芽孢桿菌屬是豆豉、納豆、水豆豉中的優勢菌種，與發酵豆制品中生物胺含量呈負相關。