基于比較基因組學解析植物乳植桿菌ST的功能基因組

楊淑娟，周金萍，李海燕，曹振輝，孫志宏，林秋葉,

（1.內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業(yè)農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古自治區(qū)乳品生物技術與工程重點實驗室，乳酸菌與發(fā)酵乳制品省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，內蒙古 呼和浩特 010018；2.云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；3.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201）

植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）屬于乳植桿菌屬，是乳酸菌的一種，其廣泛存在于食品（如蔬菜、乳肉制品等）和腸胃道等多種環(huán)境中[1]，己被人類食用或使用上千年，是一類公認安全的微生物[2]。L.plantarum具備改善腸道菌群平衡、調節(jié)免疫代謝、抵抗病原體、降低膽固醇、緩解乳糖不耐癥和加強營養(yǎng)成分吸收等益生功能，是益生菌開發(fā)的潛力貯備[3-4]。因此，L.plantarum作為潛在益生菌，在食品工業(yè)和醫(yī)療保健等領域得到廣泛開發(fā)與應用。

高通量測序技術的快速發(fā)展導致對益生菌的研究也上升到基因組學層面，越來越多的菌株完成了全基因組測序[5-6]，這種方法在基因組層面上提供了對菌株功能的新認知。比較基因組學能夠深入探究菌株的基因組及功能基因[7-8]。Mao Bingyong等[9]利用比較基因組學分析不同來源的L.plantarum基因組差異，發(fā)現L.plantarum特異基因數量與其所處的生態(tài)位有關。此外，還有研究發(fā)現L.plantarumZJ316具有膽鹽抗性和黏附于宿主腸壁的相關基因，可在胃腸道存活并定植，維持腸道菌群平衡[10]。L.plantarumDMDL 9010存在降解亞硝酸鹽的相關基因，為降低食品中的亞硝酸鹽含量提供理論參考[11]。因此，利用比較基因組學對L.plantarum功能基因分析，對其功能開發(fā)與應用具有重要意義。

本研究所用L.plantarumST分離自中國云南省德昂酸茶，已完成對L.plantarumST的全基因組測序和基因組組裝工作[12]。前期研究發(fā)現L.plantarumST對鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌表現出較強的抗菌活性，在腸道中具有良好的胃腸液耐受能力、較強的黏附和自聚力，是1 株潛在的益生菌株[13]。本研究對L.plantarumST及NCBI已公開的152 株L.plantarum全基因組序列和1 株模式菌株ATCC 14197T基因組序列進行比較基因組學分析，從基因組水平全面分析該菌株的功能基因，同時利用API 50 CHL測定該菌株的碳水化合物利用情況，旨在為使其成為功能性食品的生產菌株或微生態(tài)制劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用菌株L.plantarumST分離自中國云南德昂族傳統(tǒng)食品德昂酸茶中，由云南農業(yè)大學提供，GenBank數據庫生物保藏號為PRJNA792432。截至2021年10月10日，把NCBI（National Coalition Building Institute，https://www.ncbi.nl m.nih.gov/）Refseq數據庫中的152 株L.plantarum基因組完成圖全部下載，同時下載模式菌株L.plantarumATCC 14917T基因組完成圖。

MRS培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；API 50 CHL碳水化合物鑒定試劑條 法國生物梅里埃生物公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；臺式高速離心機 德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 比較基因組分析

1.3.1.1 平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）計算

154 株L.plantarum的ANI值計算以Goris等[14]方法為參照。再利用TBtools[14]軟件繪制ANI聚類熱圖。

1.3.1.2 泛-核心基因集構建

菌株基因組的基因預測采用Prokka[15]軟件，之后利用Roary[16]軟件識別核心基因集與泛基因集，編碼蛋白氨基酸相似性大于95%是識別核心基因的原則[8]。泛-核心基因趨勢圖繪制使用軟件R（v.4.0.4）進行。

1.3.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

核心基因序列是通過Roray軟件分析后獲得，再使用TreeBest軟件（http://www.mybiosoftw are.com/treebest）中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對系統(tǒng)發(fā)育樹進行構建，并下載NEW文件。系統(tǒng)發(fā)育樹的可視化使用在線軟件iTol完成（https://itol.embl.de/）[8]。

1.3.1.4 基因功能注釋

利用子系統(tǒng)技術的快速標注（Rapid Annotation Using Subsystem Technology，RAST）（https://rast.nmpdr.org/）數據庫、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）網站對具有代表性的、已有相關益生特性研究報道的L.plantarum全基因組功能注釋。

1.3.1.5 碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZy）注釋

將L.plantarum基因組序列上傳至在線注釋dbCAN（http://bcb.unl.edu/dbCAN2/）進行注釋，下載其注釋文件。統(tǒng)計L.plantarum基因組信息。

1.3.2 毒力和耐藥基因檢索分析

將L.plantarum氨基酸序列上傳至毒力因子數據庫（VirulenceFinder，https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/）進行比對，標準為選擇ID的閾值90%、最小長度60%。把L.plantarum氨基酸序列與耐藥基因數據庫（Comprehensive Antibiotic Research Database，CARD）（http://arpcard.mcmaster.ca）進行比對，耐藥基因的確定為比對結果中E值＜l×10-10、相似度＞50%的蛋白序列。

1.3.3 特有基因和益生基因分析

利用Prokk軟件對菌株基因組進行基因預測后，對菌株的特有基因及益生基因進行深入分析。

1.3.4 碳水化合物代謝特性分析

利用API 50CHL碳水化合物鑒定生化試劑條對L.plantarumST碳水化合物代謝情況進行表型研究，并按照試劑盒說明書操作[17]。24、48 h各觀察一次并記錄結果，以48 h觀察到結果作為最終結果。

1.4 數據分析及繪圖

利用Perl腳本統(tǒng)計基因組信息。利用TBtools繪制ANI聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 ANI分析與泛-核心基因構建

ANI是通過比對基因組的同源序列以鑒定菌株親緣關系[18]。在比較基因組學分析過程中通常認為ANI值大于95%為同一物種，ANI可用于判斷基因組間的相似性及評估基因組間多態(tài)性程度[19]。本研究對154 株L.plantarum菌株進行ANI計算，并構建聚類熱圖（圖1A）。結果表明，全部菌株之間ANI值均大于98%，表明研究所用菌株均為同一物種即L.plantarum。其中，L.plantarumST和模式菌株L.plantarumATCC 14917T的ANI為99.05%.

圖1 L.plantarum ANI值聚類熱圖（A）與泛基因集和核心 基因集曲線（B）Fig.1 Heatmap of ANI (A) and pan-core gene family curve (B)

通過Prokka和Roary軟件進行分析比較菌株間的基因差別，統(tǒng)計核、泛基因個數用大于90%的氨基酸一致性為標準。154 株L.plantarum的泛基因集包括了17378 個基因，其中核心基因1262 個，特有基因6427 個。由圖1B可知，隨基因組數量的增加，泛基因個數依然表現出增加趨勢，而核心基因個數逐漸趨于穩(wěn)定。這一現象符合開放式基因組[20]的特點，所以推測L.plantarum為開放式基因組。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

菌株間遺傳進化關系和群體結構可以通過系統(tǒng)發(fā)育樹反映[21]。為研究L.plantarumST與其余153 株L.plantarum種內遺傳進化關系，采用NJ法，以Roary軟件識別得到的1262 個核心基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），Bootstrap值為1000。

圖2 基于核心基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on core gene sequences

154 株L.plantarum中包括76 株蔬菜與谷物分離源、14 株乳制品分離源、10 株肉制品分離源、22 株腸道分離源、4 株果蠅分離源及28 株其他分離源。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，154 株L.plantarum在進化過程中由于遺傳多樣性使其被分為兩大分支，集中在1 個分支說明親緣關系更接近。ST處于第II分支中的單獨一小分支，與腸道分離株BCC9546遺傳距離較近。乳制品分離株集中在第II分支的上半部分，肉制品分離株集中在下半部分，且存在一定的聚集性。可見，乳、肉制品分離株因來源不同而存在差異。此外，呈現明顯聚集性有果蠅分離株，劉亞華等[22]探究發(fā)現果蠅分離株因為分離環(huán)境特別，它對環(huán)境的適應會獲得有利于其在該環(huán)境下生存的環(huán)境特異性基因，從而導致其具有一定分離源特異性。

從系統(tǒng)發(fā)育樹中分支中選取幾株代表性、已有相關益生特性研究報道的菌株，作為對照，與L.plantarumST繼續(xù)進行后續(xù)的比較基因組學分析。選取菌株為：JDM1、LIP-1、P8、ZJ316、ZS2058、WCSF1、ST-III、ATCC14197T、KP。

2.3 RAST注釋結果

利用RAST 軟件對10 株具有良好益生特性的L.plantarum基因組序列進行功能注釋，分析ST與其他菌株功能差異。10 株L.plantarum共注釋到25 個功能大類。由圖3可知，10 株L.plantarum中參與碳水化合物代謝的基因數量最多（21.6%），其次是氨基酸及其衍生物合成與降解（14.62%）和蛋白質代謝（11.87%）相關基因，其中氮代謝（0.21%）相關功能編碼基因僅在菌株JDM1、WCFS1、ZS2058中存在。L.plantarumST注釋到24 個功能類別。

圖3 L.plantarum RAST功能注釋結果Fig.3 Function annotation of L.plantarum strains based on the RAST database

注釋結果表明這些L.plantarum參與碳水化合物代謝的基因數量最多。碳水化合物代謝能力與基因組中存在多種編碼、運輸糖代謝的基因及相應的調控蛋白有關。因為L.plantarum可以廣泛利用多種糖源，所以可以應對更多復雜的環(huán)境[23]。很多磷酸轉移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）轉運系統(tǒng)存在于L.plantarum中，為機體輸送糖類物質是該系統(tǒng)的作用[24]。RAST注釋結果顯示WCFS1中共注釋到57 個PTS相關功能基因，ST共注釋到49 個。已有研究報道，L.plantarumWCFS1株包括完整的PTS酶II復合物以及運輸系統(tǒng)[25]，與WCFS1相比，本研究發(fā)現ST也有相同的糖類物質運送系統(tǒng)，從而確保菌株對糖的利用。

2.4 KEGG注釋結果

L.plantarumST與另外9 株L.plantarum的氨基酸序列，上傳至KEGG數據庫進行比對得到注釋結果。10 株L.plantarum在KEGG數據庫中分別在新陳代謝、細胞過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、生物系統(tǒng)和人類疾病6 大功能37 個通路上得到功能注釋，結果如圖4所示。

圖4 L.plantarum KEGG數據庫注釋結果Fig.4 KEGG annotation of L.plantarum

分析發(fā)現所有菌株的基因功能注釋主要分布于代謝通路中，碳水化合物代謝是11 個代謝通路中基因數量最多的，共2008 個基因占代謝通路注釋基因的23.2%。氨基酸代謝次之。環(huán)境信息處理中最多注釋的是信號轉導和膜運輸，其中信號轉導通路主要集中于ABC轉運蛋白。多種糖類的代謝通路包含在碳水化合物代謝通路中，L.plantarumST中碳水化合物代謝多達200 個基因注釋量，推測L.plantarumST可能有較強的糖類分解及代謝功能，為機體提供能量[6]。

免疫相關基因的通路信息及其通路ID如表1所示。可調控免疫和炎癥的通路相關基因，包括過氧化物酶體增生物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）和維甲酸誘導基因I（retinoic acid-induced gene I，RIG-I）通路。其中，STGL000154、STGL002738參與PPAR信號通路的調控，PPAR通路與細胞分化、炎性反應和能量代謝等緊密相連。在RIG-I樣受體信號通路的調控中基因STGL000333參與，RIG-I樣受體是固有免疫的模式識別受體，這個受體可以辨別非自身的病毒RNA，通過激活該受體信號通路最終達到促進細胞因子生成的目的，從而發(fā)揮出抗病毒的功效[26]，這可 能是L.plantarum具有抗病毒作用的因素。推測L.plantarumST能夠幫助宿主抵抗病原菌的侵襲、進而調節(jié)腸道菌群的平衡。

表1 L.plantarum ST基因組免疫調控通路相關基因Table 1 Genes related to genomic immune regulatory pathway in L.plantarum ST

2.5 CAZy注釋結果

為了從基因組層面探究L.plantarumST對碳水化合物的利用能力，利用CAZy數據庫分析了10 株L.plantarum的CAZy功能基因。5 種CAZy類在這10 株L.plantarum中被注釋到，分別為碳水化合物碳結合結構域（carbohydrate-binding modules，CBMs）、糖苷水解酶類（glycoside hydrolases，GHs）、輔模塊酶類（auxiliary activities，AAs）、糖苷轉移酶類（glycosyl transferases，GTs）、碳水化合物酯酶類（carbohydrate esterases，CEs）。10 株L.plantarum共注釋到47 個CAZy基因家族，包括24 個GHs家族、12 個GTs家族、4 個CEs家族、4 個CBMs家族和3 個AAs家族。

由圖5可知，ST及另外9 株菌注釋到的GHs、GTs含量最為豐富，無顯著差異。GHs可水解或重排糖苷鍵，將多糖水解為單糖，給予菌體能量[27]。GTs催化糖基與其他糖類或非糖物質的基團進行轉移，負責糖苷鍵的形成[28]。其中，GT4在L.plantarum中拷貝數最多（平均約13 個），其次是GT2（平均約11 個）和GH1（平均約10 個）。本研究10 株L.plantarum注釋到了24 個GHs，含量豐富。ST的GH家族中含量最多的是GH1、GH13_31，還包括GH170、GH25、GH65、GH73、GH78、GH36等。在纖維素降解的過程中糖苷水解酶類中一些酶類有水解作用，利用關鍵限速酶β-葡萄糖苷酶能把纖維二糖在內的纖維寡糖分解為單糖[4]，故推測L.plantarumST具有良好的降解纖維素潛力。所有L.plantarumGT家族中GT2、GT4含量最多，主要編碼蔗糖合酶、纖維素合酶等眾多酶類，與蔗糖等二糖以及脂多糖、纖維素等合成有關。CBM家族能夠促進催化活性結構域與碳水化合物的結合。由圖可知注釋到CBM32、CBM34、CBM48，其中CBM 48主要來自糖苷水解酶，多為普魯蘭酶、異淀粉酶、分支酶等。CBM的多樣性使其在底物特異識別、促進酶與底物結合及酶穩(wěn)定性等方面均有重要作用[29]。

圖5 L.plantarum CAZy數據庫注釋結果Fig.5 Annotation results of L.plantarum based on CAZy database

通過碳水化合物注釋結果推測L.plantarumST有著較強的水解或重排糖苷鍵能力，同時可能具有良好的降解纖維素潛力。良好糖苷水解能力為L.plantarumST用于益生菌制品奠定了基礎。

2.6 毒力和耐藥基因檢索分析

安全性評價是判斷一株菌是否為益生菌最為關鍵的一步，一般通過研究菌株的抗生素抗性、有毒代謝物等指標評估乳酸菌的安全性[30]。抗生素濫用嚴重導致細菌產生耐藥性。將L.plantarumST與其他9 株L.plantarum的基因組經毒力因子、耐藥基因數據庫比對后發(fā)現均不存在毒力因子和耐藥基因，故認為L.plantarumST是安全的，并且沒有潛在的耐藥性。

2.7 特有基因和益生基因分析

為進一步挖掘L.plantarumST功能基因同時解析其潛在的益生功能基因，繼續(xù)對菌株的特有基因和益生基因進行分析。L.plantarumST存在41 個特有基因，除去一些假定蛋白編碼基因后，L.plantarumST有3 個特有功能基因，表2為特有功能基因信息，分別為乙二醛還原酶基因（yvgN）、酪氨酸重組酶基因（xerC）、能量耦合因子轉運蛋白基因（ecfT）。yvgN是一種加氫酶，對乙二醛進行加氫反應。ecfT是一種轉運酶，負責攝入一些維生素及其他微量元素[31]。

表2 154 株L.plantarum中L.plantarum ST特有功能基因Table 2 Unique genes of L.plantarum ST

基于前期對L.plantarumST益生功能的研究[13]，使用Prokka軟件注釋到L.plantarumST含有與益生特性相關的基因，具體信息見表3。群體感應AI-2信號分子合成的最關鍵蛋白酶是S-核糖同型半胱氨酸裂解酶（LuxS），AI-2 在微生物種內和種間交流起到重要作用，在L.plantarumST中發(fā)現了該基因。目前發(fā)現在超過80 種細菌中均存在LuxS基因[32-33]，細菌許多生理現象離不開LuxS介導的群體感應系統(tǒng)，因為這種系統(tǒng)對細菌有重要的調節(jié)作用[34]。L.plantarumST還含有谷胱甘肽合成（garB、gshAB）、核黃素合成（ribBA、ribE、ribF）相關基因，有研究表明[35]谷胱甘肽不僅有助于維持正常的免疫系統(tǒng)功能，同時有整合解毒與抗氧化作用。此外，菌株在胃腸道存活率的增加也與谷胱甘肽有關[36]，該物質有助于菌株益生功能的發(fā)揮。核黃素（VB2），作為輔酶有助于代謝是其主要功能。NAPPH還原酶類（nfrA），參與脂肪酸、核苷酸和脂類的合成等多種合成代謝反應，該物質起到遞氫體的作用在生物體內的化學反應中[37]。L.plantarumST還注釋到了黏附因子（atpC）基因，黏附因子有助于細菌在宿主體內的定植因為可使菌株牢固黏附于宿主細胞表面。研究還發(fā)現，L.plantarumST存在提高宿主代謝能力（tagE）、乳酸和轉運乳酸（pyk、ldh）、細胞壁特殊組分成分（ItaS）和生物活性肽（lmrA）產生相關的基因，可提高菌株益生功能。

表3 L.plantarum ST具有的益生特性相關基因Table 3 Genes related to probiotic characteristics of L.plantarum ST

特有基因和益生基因分析發(fā)現，L.plantarumST含有與黏附能力、信號分子傳遞和抗氧化能力等相關的益生功能基因。因此，本研究從基因組水平揭示L.plantarumST具有益生特性相關基因，認為其是1 株具有潛在益生功能的菌株。

2.8 碳水化合物代謝特性

為了評估L.plantarumST對不同碳源的利用能力，利用API 50 CHL碳水化合物鑒定試劑條對ST的碳水化合物代謝進行研究，挖掘出可被ST利用的碳源，為碳水化合物代謝中的功能基因分析提供表型數據支持，同時為該菌株在之后的應用提供借鑒。

如表4所示，API 50 CHL碳水化合物鑒定試劑條所涉及的49 種碳水化合物中，可被ST利用的共有28 種，劃分為單糖類（9）、糖苷類和二糖類（12）、多糖類（1）、醇類（4）、鹽類（2）物質五大類。單糖類包括：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺；糖苷類和二糖類包括：熊果苷、水楊苷、苦杏仁苷、七葉靈、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-龍膽糖、D-松二糖；多糖類包括：D-松三糖；醇類包括：丙三醇、肌醇、甘露醇、山梨醇；鹽類包括：葡萄糖酸鉀、5-酮基葡萄糖酸鉀。

表4 L.plantarum ST API 50 CHL分析Table 4 Analysis of API 50 CHL in L.plantarum ST

糖發(fā)酵實驗結果顯示，L.plantarumST可代謝不同種類豐富的碳源，包括9 種單糖、12 種糖苷和二糖、1 種多糖及4 種醇類和2 種鹽類物質，再次說明了ST具有較強的碳水化合物代謝能力。該結果與本實驗KEGG注釋以及CAZy分析吻合，利用基因組學和表型分析相結合，發(fā)現L.plantarumST擁有較好的產CAZy能力，具備豐富的碳水化合物利用能力，可為開發(fā)相關酶制劑提供一定的參考價值。

3 結論

對L.plantarumST結合NCBI已公開的152 株L.plantarum全基因組序列和1 株模式菌株ATCC 14197T的基因組序列進行比較基因組學分析。ANI分析鑒定ST為L.plantarum，系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現L.plantarumST與腸道分離株BCC9546遺傳距離較近，乳、肉制品分離株因來源不同而存在差異，分別集中在第II分支的上半部分和下半部分，同時果蠅分離株有明顯聚集趨勢。RAST和KEGG功能注釋發(fā)現，L.plantarumST參與碳水化合物代謝的基因數量最多，包含大量的PTS相關基因，還發(fā)現PPAR和RIG-1免疫調控通路相關基因。CAZy注釋發(fā)現，L.plantarumST有較多水解或重排糖苷鍵的基因，可能具有良好的纖維素降解能力。毒力和耐藥注釋比對后發(fā)現ST不存在毒力因子和耐藥基因。特有基因分析發(fā)現，L.plantarumST攜帶特有的與能量轉運功能有關功能基因ecfT；益生特性基因顯示，L.plantarumST具有與群體感應信號分子AI-2（LuxS）、黏附分子（atpC）和谷胱甘肽（garB、gshAB）合成相關的功能基因。API 50 CHL碳水化合物代謝結果顯示，L.plantarumST可代謝單糖類、糖苷和二糖類及多糖類等中的29 種碳源，ST能夠利用的碳源非常豐富。綜上，本研究從基因組水平分析了L.plantarumST功能基因組特征，結合糖發(fā)酵表型結果，認為L.plantarumST是1 株安全且具有潛在益生特性基因的益生菌，為后續(xù)L.plantarumST益生功能開發(fā)及其生產應用奠定了遺傳學基礎。