基于對硝基苯酚熒光內濾效應的脂肪酶活性測定

徐 陽，辛嘉英,2,*，李慧敏，王貴儒，王雨晴

（1.哈爾濱商業大學 食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

脂肪酶的定義是催化甘油三酯水解成脂肪酸和甘油、單甘油酯或甘油二酯的酶，也叫做三酰甘油酯水解酶，可進行酯交換、酯化等，其廣泛存在于動物、植物等生物體內[1-2]。隨著天然酶制劑應用越來越廣泛，脂肪酶在食品工業中也占據了重要地位[3]。尤其脂肪酶活性對食品品質有很大影響，其酶活性測定也成為食品檢測中十分重要的環節[4]。傳統測定脂肪酶活性的方法包括平板法、滴定法、比色法、熒光法[5-8]等，其中平板法、滴定法是操作相對簡便的兩種方法，但由于其靈敏度較差，測定結果不準確，因此只能用來粗略判斷脂肪酶活性大小；比色法雖然反應靈敏度高但操作流程復雜，易受反應介質、底物和環境因素如溫度、pH值的影響，具有反應不穩定等缺點[9-10]，因此，開發新方法測定脂肪酶活性將成為未來研究的重點。

基于納米金以及金納米簇的光學性質測定脂肪酶活性具有簡便快速、靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點，是一種良好的測定脂肪酶方法[11-12]。孫旭東[13]為檢測脂肪酶活性，研究了一種熒光探針。利用合成的氮金摻雜熒光納米點，使其表面氨基與銅離子配位結合，使熒光淬滅。巰基乙酸甲酯在脂肪酶作用下發生水解反應，其水解產物巰基乙酸和銅離子的結合作用大于納米點與銅離子的結合作用，最終導致銅離子脫離熒光納米點，使得熒光強度恢復。通過建立標準曲線，從而得出脂肪酶活性大小。田丹碧等[14]研究了一種納米金團簇熒光增強法檢測脂肪酶活性。其原理是利用脂肪酶水解巰基乙酸甲酯產生巰基乙酸，巰基乙酸能與納米金團簇穩定結合，使得納米金團簇熒光發射強度增加。但利用納米金法測定脂肪酶活性時，脂肪酶中蛋白含量會對實驗結果造成一定影響，對脂肪酶特殊作用界面的理論研究也并不充分[15-16]。因此，應不斷深入開發納米金的制備及檢測新技術，成功實現對脂肪酶活性靈敏性的測定。

隨著學者們對熒光法認識的進一步加深，熒光內濾法已經發展成了一種新型熒光分析方法[17]，早在1991年就被Gabor等[18]報道。熒光內濾效應指在反應體系中熒光劑的激發或發射光被吸收劑所吸收，進而導致熒光劑的熒光強度降低[19-20]。由于吸收劑對熒光基團的吸收程度可轉變為熒光強度的變化，其檢測靈敏度在一定程度上也大大提高，檢出限也顯著降低[21]。目前，基于熒光內濾效應的檢測已廣泛應用于食品、藥品、環境等領域[22-24]。本研究提出一種基于熒光內濾機理測定脂肪酶活性的傳感系統。金納米簇具有良好熒光性能可以成為理想的熒光劑，利用谷胱甘肽制備金納米簇，其激發波長為420 nm。對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）在405 nm波長處有紫外吸收峰，二者之間吸收與激發圖譜重疊，熒光劑的熒光被猝滅，可利用熒光內濾效應達到對脂肪酶活性檢測的目的。金納米簇可作為反應體系的熒光團，棕櫚酸對硝基苯酯（p-nitrophenyl palmitate，p-NPP）在脂肪酶的作用下可水解轉化為p-NP，作為熒光內濾的吸收劑可影響金納米簇的激發導致熒光強度降低，檢測機理如圖1所示。該方法具有操作簡便、靈敏度高以及樣品消耗少等優點，在脂肪酶活性檢測方面具有良好的應用前景，在食品工業領域具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（分析純）天津佳燁貴研科技有限公司；谷胱甘肽（98%）、p-NPP（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris-HCl、牛血清白蛋白（均為分析純）北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、無水乙醇、阿拉伯膠、氫氧化鈉（均為分析純）天津市天力化學試劑有限公司；TritonX-100、異丙醇、磷酸（均為分析純）天津光復化工開發中心；考馬斯亮藍G-250（分析純）上海躍騰生物技術有限公司；硝酸、鹽酸（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；脂肪酶Nvozyme435（分析純）諾維信（中國）投資有限公司；豬胰脂肪酶（30 U/mg）（分析純）上海金穗生物科技有限公司；假絲酵母脂肪酶（700 U/mg）（分析純）上海源葉生物科技有限公司；皺褶假絲酵母脂肪酶（700 U/mg）（分析純）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

KQ-50B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限 公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋、DHG-9053A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；BSA224S電子天平、PB-10酸度計 賽多利斯科學儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV2550紫外-可見光譜儀 島津消耗品銷售 公司；F-7000FL熒光分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 金納米簇合成

根據文獻報道的方法[25]合成了谷胱甘肽修飾的金納米簇。將10 mL 4 mmol/L氯金酸溶液添加到10 mL 6 mmol/L谷胱甘肽溶液中。將混合物溶液混合，置于油浴鍋中，設置溫度為90 ℃，攪拌時間6 h。再使用10 kDa MWCO膜過濾器純化。將得到的濾液收集，置于冰箱，4 ℃保存備用。

1.3.2 脂肪酶底物溶液的制備[26]

溶液A：p-NPP 3 mg，溶于10 mL異丙醇中。溶液B：稱量TritonX-100溶液2 g，阿拉伯膠0.5 g，將兩者溶于450 mL的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）中，獲得混合物溶液B。將溶液A與溶液B按1∶9比例混合配制為乳狀液，穩定2 h左右，即可獲得脂肪酶的底物溶液C。

1.3.3 脂肪酶活性的檢測

將50 μL不同活性脂肪酶添加到含450 μL脂肪酶的底物溶液C中，并加入1.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 7.5）調節pH值。然后在50 ℃水浴中加熱18 min，再加入400 μL谷胱甘肽-金納米簇溶液到反應物中，于激發波長420 nm處得到金納米簇的熒光圖譜。

1.3.4 考馬斯亮藍法測定脂肪酶中蛋白含量[27]

染色液配制：將考馬斯亮藍G-250100 mg添加到100 mL 95%乙醇溶液中，再加100 mL 85% H3PO4溶液，加蒸餾水稀釋至1 L。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標準液：0.1 mg/mL。標準曲線：在6 支試管中分別加不同體積的BSA溶液，另取一支試管加1 mg/mL脂肪酶溶液1 mL，將7 支試管分別加水定容至1 mL。每管加入5 mL染液，搖勻，放置5 min，測OD595nm值，通過標準曲線測定脂肪酶的蛋白含量。

1.3.5 比色法測脂肪酶活性

p-NP標準曲線：配制濃度在2.5～32.5 μmol/L的p-NP溶液，在波長405 nm波長處比色，以p-NP濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程。進而計算求得脂肪酶活性，具體方法可參見p-NP 法[28-29]，計算公式如下：

式中：X為脂肪酶活性/（U/mL）；C為p-NP濃 度/（μmol/mL）；V為最終體積/mL；V′為脂肪酶的添加量/mL；t為反應時間/min。

2 結果與分析

2.1 谷胱甘肽-金納米簇合成

合成谷胱甘肽修飾的金納米簇電鏡如圖2A所示，其粒徑約為2 nm。如圖2B所示，形成的金納米簇在420 nm激發波長下，580 nm處出現熒光發射峰，在紫外光照射下顯示紅色熒光。

圖2 金納米簇的透射電鏡圖（A）和熒光光譜圖（B）Fig.2 TEM image (A) and fluorescence spectrum (B) of gold nanoclusters

2.2 金納米簇的穩定性

探究光穩定性、溫度和pH值對金納米簇的影響。由圖3A可知，金納米簇在420 nm處照射60 min，其歸一化熒光強度幾乎沒有變化，表明金納米簇具有良好的光穩定性。圖3B表明，反應溫度范圍在30～50 ℃之間時，對金納米簇的歸一化熒光強度幾乎沒有影響。如圖3C所示，pH值對金納米簇有一定的影響，熒光強度隨著pH值升高而增加，因此要嚴格控制金納米簇起始溶液的pH值，這種現象的發生可能是由金納米簇表面官能團的質子化-去質子化所引起[30-31]。

圖3 抗光漂白性（A）、溫度（B）和pH值（C）對金納米簇的影響Fig.3 Photobleaching resistance of gold nanoclusters (A) and effect of temperature (B) and pH (C) on gold nanoclusters

2.3 基于熒光內濾的熒光傳感機理

如圖4A所示，在脂肪酶存在條件下，p-NPP被水解成p-NP造成吸收峰紅移，從275 nm處紅移到405 nm處。金納米簇的激發波長在420 nm處，發射波長在580 nm處，則p-NP的紫外吸收光譜和金納米簇的激發光譜存在一定的重疊現象，使金納米簇的熒光減弱。

圖4 熒光法測脂肪酶活性的反應機理圖Fig.4 Fluorescence spectra and effect of the inner filter effect on fluorescence intensity

為證明金納米簇熒光降低僅僅是由于脂肪酶水解產生的p-NP與金納米簇的熒光內濾引起，進行如下實驗，當金納米簇中加入酶或p-NPP時，對金納米簇熒光強度基本上沒有影響，當加入p-NPP和脂肪酶時，其熒光強度減弱，證明了脂肪酶水解p-NPP產生的p-NP與金納米簇的熒光內濾效應減弱金納米簇熒光強度，其他物質對金納米簇的熒光沒有影響，當在金納米簇中直接加入p-NP時，其熒光強度減弱，直接證明了該方法的有效性，見圖4B。

基于p-NP紫外吸收和金納米簇激發光譜之間的強烈重疊，使熒光強度發生降低，而p-NP的紫外光譜又會受到脂肪酶活性影響。當脂肪酶活性較大時，對p-NPP的水解程度高，產生的p-NP濃度大，則p-NP紫外光譜圖與金納米簇的激發光譜重疊大，導致熒光顯著降低；反之脂肪酶活性小，對熒光強度的影響不大，熒光強度相對較高。對不同活力的皺褶假絲酵母脂肪酶水解產生的p-NP做了紫外光譜檢測，如圖5所示，其吸光度隨著脂肪酶活性的增大而增加。

圖5 不同活性褶皺假絲酵母脂肪酶的紫外-可見光譜圖Fig.5 UV-visible spectra of Candida rugosa lipase with different activities

2.4 反應條件的優化

通過實驗優化pH值、p-NPP質量濃度、脂肪酶水解時間和溫度對金納米簇熒光強度的影響。以相對熒光強度（熒光強度差值F0-F）作為脂肪酶活性大小當量，即脂肪酶活性越大時，水解產生的p-NP濃度越大，熒光內濾效應越強，對金納米簇的熒光減弱越大，相對熒光強度越大；反之，脂肪酶活性越小，相對熒光強度越小。如圖6所示，p-NPP質量濃度在0.8～3.2 mg/mL之間，隨質量濃度增大而增加，在1.6 mg/mL基本達到平衡，選擇最適質量濃度為1.6 mg/mL。其最適pH值為7.5，最適溫度50 ℃，時間為20 min。

圖6 褶皺假絲酵母脂肪酶檢測實驗條件優化Fig.6 Optimal conditions for CRL activity detection

2.5 脂肪酶活性的檢測

圖7顯示了在不同皺褶假絲酵母脂肪酶活性條件下，金納米簇熒光的改變。隨著皺褶假絲酵母脂肪酶活性的增強，金納米簇熒光強度逐漸降低。相對熒光強度（F0-F）與皺褶假絲酵母脂肪酶活性在5.6～196 U/L范圍內呈正相關。線性方程y=2.0035＋0.9368x，相關系數r2=0.9978，檢出限為1.3 U/L（信噪比為3）。該檢測方法與比色法相比，其檢出限更低，并且不需對金納米簇進行修飾，檢測方法簡單靈活，可應用于實際脂肪酶活性的檢測。

圖7 脂肪酶活性檢測的熒光圖譜Fig.7 Fluorescence spectra for lipase activity detection

2.6 抗干擾檢測

為了探究該反應體系的抗干擾性，在溶液中加入乳糖、甘露糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、酪蛋白、纖維素酶、葡萄糖苷酶、淀粉酶、木聚糖酶、絲氨酸、木瓜蛋白酶。如圖8所示，金納米簇的相對熒光強度幾乎不受這些物質影響，而脂肪酶加入后相對熒光強度明顯升高，結果表明該方法對脂肪酶有良好的選擇性。

圖8 抗干擾檢測Fig.8 Evaluation of anti-interference ability

2.7 熒光法與比色法對不同脂肪酶活性比較

為驗證結果的可靠性，采用p-NP法對不同種類脂肪酶活性進行了測定，見表1，比色法的測定結果與本研究所建立熒光法檢測脂肪酶活性結果順序一致，即皺褶假絲酵母脂肪酶＞假絲酵母脂肪酶＞豬胰脂肪酶。雖然本方法所采用的酶活性參數與比色法不同，但脂肪酶活性的變化趨勢完全一致。本方法采用相對熒光強度（F0-F）當作脂肪酶活性大小的參數，相對熒光強度越高，說明脂肪酶活性越高。

表1 熒光法與比色法對不同脂肪酶活性比較Table 1 Comparison of lipase activity determined by fluorescence and colorimetric methods

3 結論

探究了一種基于熒光內濾效應檢測脂肪酶活性的方法，在該反應體系中，以谷胱甘肽為修飾劑體和還原劑合成了谷胱甘肽-金納米簇，其作為反應體系的熒光團，在脂肪酶的作用下，p-NPP水解為p-NP，其作為熒光的吸收劑，利用熒光內濾機理測定脂肪酶活性。該方法具有操作簡便、靈敏度高以及樣品消耗少等優點，在脂肪酶活性檢測方面具有良好的應用前景。