電流刺激對鈍齒棒桿菌厭氧條件下代謝通量分布的影響

陳小舉，張鳳琴

（巢湖學院生物與環境工程學院，安徽 巢湖 238000）

在食品、藥品等行業中，琥珀酸與乳酸及其衍生物有著廣泛應用。以琥珀酸與乳酸為前體可以合成具有廣闊應用前景的可降解生物材料，因此，市場對琥珀酸與乳酸的需求旺盛。利用微生物發酵可再生資源生產琥珀酸與乳酸被認為是減少石化資源消耗和減少碳排放的有效手段，也是最具發展潛力的綠色工藝模式之一[1-4]。

鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）是生產精氨酸、谷氨酸等氨基酸的主要菌株之一。鈍齒棒桿菌產氨基酸的發酵工藝多是有氧液體深層發酵，且對溶氧水平有較嚴格的要求[5]。將鈍齒棒桿菌培養環境改為無氧時，琥珀酸與乳酸是其主要代謝產物。研究發現，C4途徑是鈍齒棒桿菌厭氧合成琥珀酸的主要途徑，即由磷酸烯醇式丙酮酸至草酰乙酸，然后經蘋果酸與富馬酸生成琥珀酸[6]（圖1）。理論上，轉化1 mol磷酸烯醇式丙酮酸可以生成1 mol琥珀酸，并需要2 mol還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）。糖酵解途徑（Embden Meyerhof pathway，EMP）是鈍齒棒桿菌代謝葡萄糖的主要途徑，此途徑每生成1 mol磷酸烯醇式丙酮酸僅伴隨生成1 mol NADH，僅能滿足由草酰乙酸至蘋果酸或者由富馬酸至琥珀酸所需的NADH。因此，厭氧發酵時，鈍齒棒桿菌將70%左右的葡萄糖轉化為乳酸，而琥珀酸的代謝通量相對較低，不利于聯產乳酸與琥珀酸[7-8]。

圖1 鈍齒棒桿菌在厭氧條件下的代謝網絡Fig.1 Metabolic network of C.crenatum under anaerobic conditions

如果要提高琥珀酸生成比例，利用代謝調控增加琥珀酸生產菌胞內的H還原力水平是可行的方法。比如，Zheng Pu等[9]利用基因組改組技術增加Actinobacillus succiniogenes胞內NADH通量，將琥珀酸產量提高了73%；Zhou Zhihui等[10]發現表達外源pntAB基因可以明顯增加谷氨酸棒桿菌胞內的NADH通量與琥珀酸產量。另一提高琥珀酸產量的有效措施是通過添加電子供體、NAD前體物質調控胞內NADH/NAD＋值。如姜岷等[11]通過流加還原劑改變發酵培養基的氧化還原電位水平，實現了對A.succinogenes胞內NADH代謝的調控，將琥珀酸生產效率提高了57.3%[11]。

除以上方法外，電刺激發酵也可用于調控微生物胞內的NADH代謝。電刺激發酵就是將惰性電極插入微生物培養液中，形成一種電解池系統[12]。當施加電流后，在陰極會產生電子，電子通過傳遞進入微生物胞內可以提高NADH/NAD＋值[13]。電壓達到一定值后，陰極還會發生還原反應而產生氫氣。產生的氫氣可降低胞外氧化還原電位，并作為電子傳遞供體使胞內NADH/NAD＋值升高。電刺激發酵技術在發酵產氫、丁醇、丙二醇、琥珀酸等高還原性代謝產物的工藝中得到了初步應用。已有研究發現，低壓、低電流刺激可以提高厭氧發酵產氫的能力，其主要原因是微生物胞內NADH可用水平的增加[14-15]。與琥珀酸相似，NADH不足也是導致丁醇產量較低的主要原因[16]。He Aiyong等[17]發現電刺激發酵可以提高Clostridium beijerinckiiIB4胞內的NADH/NAD＋值，并導致丁醇的產量及生產效率分別增加17.4%與60.3%。Zhou Mi等[18]發現施加電流刺激可以提高甘油對1,3-丙二醇的轉化率，代謝流分析結果顯示NADH通量增加是1,3-丙二醇產量升高的主要原因。Wang Zhen等[19]研究結果表明，對A.succinogenes發酵過程施加電流刺激可以將琥珀酸提高22.4%。

電化學技術在微生物發酵領域的應用為發酵過程控制及微生物代謝調控提供了新的研究方向[13,20]，但電刺激對鈍齒棒桿菌厭氧發酵特性的影響尚不明確，菌株胞內哪些節點的代謝流分布對電流刺激脅迫產生了應激響應尚不清楚。且目前為止，此方面的研究甚少。因此，本研究以鈍齒棒桿菌為發酵菌株，通過改變厭氧發酵過程中的電流強度對胞內NADH代謝進行調控，以提高琥珀酸產量，并對不同電流條件下的代謝通量及基因表達水平進行分析，考察電刺激對鈍齒棒桿菌代謝流分布的影響，找出可以聯產乳酸與琥珀酸的電流刺激條件。本研究結果將有助于在理論方面掌握電流刺激對鈍齒棒桿菌厭氧發酵特性的影響，在應用方面可建立提高琥珀酸生產效率的電刺激發酵工藝，同時對推動發酵工程與電化學學科的交叉融合也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鈍齒棒桿菌CICC20219，目前由巢湖學院生物工程實驗室保藏。

1.1.2 培養基

培養基A主要用于微生物的快速繁殖，主要成分：葡萄糖40 g/L，尿素2 g/L，酵母提取物2 g/L，酪蛋白氨基酸7 g/L，(NH4)2SO47 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.006 g/L，MnSO40.0042 g/L，生物素0.0002 g/L、硫胺素0.0002 g/L[21]。

培養基B 主要用于厭氧發酵產乳酸與琥珀酸，主要成分：葡萄糖60 g/ L，NaHCO316.8 g/ L，KH2PO40.5 g/ L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.006 g/L，MnSO40.0042 g/L，生物素0.0002 g/L、硫胺素0.0002 g/L[21]。

1.1.3 試劑盒

NADH與NAD＋濃度檢測試劑盒（產品序號：A114）、RNA提取試劑盒（產品序號：NO65）、cDNA合成試劑盒（產品序號：N118）南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

ACQUTIY UPLC H-Class plus超高效液相色譜系統 美國Waters公司；FQD-96A實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 杭州博日科技股份有限公司；CHI660E電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；ACQUTIY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUTIY UPLC BEH Amide Carbohydrate Analysis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）愛爾蘭Waters公司；全溫搖瓶柜 蘇州培英公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

本研究采用的發酵工藝可分為2 個階段：有氧階段與厭氧階段。有氧階段主要用于鈍齒棒桿菌的快速繁殖，目的是獲得大量的菌體；厭氧階段主要為代謝葡萄糖生產有機酸的發酵階段。主要過程如下：挑取鈍齒棒桿菌接種于含30 mL培養基A的250 mL搖瓶中，于30 ℃、200 r/min培養12 h，按照10%接種量轉接于含100 mL培養基A的500 mL搖瓶中，然后于30 ℃、200 r/min培養10～12 h。將培養液于5000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液并收集菌體，然后將菌體接種于厭氧發酵培養基B，接種量：生物量干質量濃度約為8 g/L。

厭氧發酵階段使用100 mL的H型電解池為發酵容器（圖2）。H型電解池為3電極體系，鉑片電極（10 mm×10 mm×0.1 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，且置Ag/AgCl電極于陰極電解池，并使用質子膜將陰極與陽極隔開。陽極與陰極電解池均含有80 mL培養基B，唯一不同的是：添加3 g堿式MgCO3于陰極電解池，用于中和產生的有機酸。電流通過電化學工作站提供，開環條件下的電解池系統為對照組，默認電流大小為0 mA。

圖2 H型電解池發酵系統示意圖Fig.2 Schematic view of H-type electrolytic fermentor

1.3.2 分析檢測

細胞數量通過檢測OD600nm和干質量進行評估。NADH與NAD＋濃度由輔酶I檢測試劑盒測定。利用超高效液相色譜對有機酸和殘糖含量進行分析。檢測有機酸時，采用二極管陣列檢測器，色譜柱為ACQUTIY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.003 mmol/L硫酸溶液，流速為0.2 mL/min，檢測波長為210 nm。檢測殘糖時，采用蒸發光檢測器，色譜柱為ACQUTIY UPLC BEH Amide Carb ohydrate Analysis C18色譜柱，流動相為80%乙腈溶液，流速為0.4 mL/min。

1.3.3 基因表達水平分析

鈍齒棒桿菌在厭氧條件下培養4 h后，利用TRIzol法提取總RNA，然后反轉錄得到cDNA，以16S RNA為內參基因，利用real-time PCR儀對6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因（zwf）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pepc）、蘋果酸脫氫酶基因（mdh）及乳酸脫氫酶基因（ldhA）的表達水平進行分析。RNA提取與cDNA合成分別使用相關試劑盒完成。使用的引物如表1所示，引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 real-time PCR使用的特異性引物Table 1 Specific primer sequences used for real-time PCR

1.3.4 代謝通量分析

鈍齒棒桿菌在厭氧條件下培養時，生物量基本沒有變化[8,22]。因此，本研究不考慮生物量對代謝通量分布的影響。代謝通量計算過程中，假設胞內代謝反應的中間代謝產物處于擬穩態，并能及時轉化為下游產物，同時設定NADH與NADPH可無限制相互轉換。鈍齒棒桿菌在厭氧條件的代謝網絡如圖1所示，主要由EMP、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，HMP）、琥珀酸、乳酸、乙酸等合成途徑組成。由圖3可知，代謝通量計算時共有27 個變量，圍繞6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等代謝中間體可列出代謝通量方程21 個（表2），圍繞NADH（NADPH）平衡、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）平衡可列出代謝通量方程2 個，即共有23 個代謝通量方程，方程自由度為4，因此，需要測定4 個變量才能對代謝通量方程進行求解。本研究取厭氧發酵4 h的發酵液進行代謝產物分析，通過離線精確檢測殘糖、乳酸、琥珀酸和乙酸等變量，以求解代謝通量方程。

表2 代謝通量方程Table 2 Equations of metabolic flux balance

圖3 變量分布示意圖Fig.3 Schematic diagram of variables

2 結果與分析

2.1 電流刺激對發酵結果的影響

本研究以H型電解池為發酵容器，在發酵過程中通過施加電流刺激改變鈍齒棒桿菌胞外培養環境，研究電流刺激對其代謝特性的影響，結果如圖4所示。研究發現，通入電流對鈍齒棒桿菌在厭氧條件下發酵特性產生了較為明顯的影響。在對照組（未通電），鈍齒棒桿菌在8 h內共消耗葡萄糖58.7 g/L（圖4a），葡萄糖消耗速率為7.3 g/（L·h）（圖5）。施加-2 mA與-5 mA電流刺激后，在相同時間內，鈍齒棒桿菌消耗的葡萄糖分別達到65.7 g/L（圖4b）與74.7 g/L（圖4c），葡萄糖消耗速率分別為8.2 g/（L·h）與9.3 g/（L·h），與對照組相比，分別增加12.3%與27.4%。以上結果說明，通入電流對葡萄糖的代謝效率具有顯著促進作用。導致鈍齒棒桿菌在電流刺激條件下糖代謝效率增加的可能原因是細胞膜通透性的提升。因為，鈍齒棒桿菌吸收利用葡萄糖的過程主要分為跨膜運輸與糖酵解，葡萄糖只有通過細胞膜進入胞內才能被微生物進一步利用，而研究顯示適度的電流刺激會增加細胞膜的通透性[23]。另外，細胞膜通透性增加還會加速胞內代謝產物（琥珀酸與乳酸）向胞外的轉運效率，減弱胞內代謝產物反饋抑制，提升胞內的整個代謝速率。與本研究結果相似，Wang Kai等[24]也發現，施加電流刺激可以增加硫酸鹽還原細菌細胞膜的通透性，并加速底物與代謝產物的跨膜轉運。

圖4 不同電流刺激條件下的發酵結果Fig.4 Fermentation characteristics under different electrical current stimulation conditions

圖5 不同電流刺激條件下的葡萄糖消耗速率Fig.5 Glucose consumption rates under different electrical current stimulation conditions

施加電流刺激后，發酵液中的乳酸與琥珀酸質量濃度均高于對照組。無電流刺激條件下，發酵液中的乳酸質量濃度在8 h達到43.9 g/L（圖4a）。當電流為-2 mA與-5 mA時，乳酸質量濃度分別為45.0 g/L（圖4b）與46.5 g/L（圖4c），與對照組比，分別增加了2.5%和5.9%。對照組實驗的乳酸質量濃度在3 組中雖然是最低的，但其乳酸產量（每代謝1 g葡萄糖產生的乳酸質量）最高，達到0.75 g/g（圖6），分別比-2 mA與-5 mA實驗組高出10.3%與21.0%。通入電流可以明顯提高發酵液中琥珀酸質量濃度及琥珀酸產量，電流越小，琥珀酸質量濃度與產量越高。當電流由0 mA（對照組）變為-5 mA時，琥珀酸質量濃度由13.8 g/L增加到28.9 g/L，琥珀酸產量由0.24 g/g增加到0.39 g/g（圖6），與對照組相比，質量濃度與產量分別增加了109.4%和62.5%。同時，琥珀酸與乳酸產量比由0.32增加到0.63。以上結果說明，電流刺激可以改變鈍齒棒桿菌在厭氧條件下的代謝物組成，并有利于提高需要較多H還原力的代謝產物的合成，如琥珀酸。

圖6 不同電流刺激條件下的有機酸產量Fig.6 Organic acid yields under different electrical current stimulation conditions

微生物培養過程中，向反應系統施加電流刺激可以在培養液中產生更多的電子，電子通過傳遞進入細胞會對胞內NADH代謝產生影響，繼而影響微生物整體代謝特性[13,20,25]，比如代謝產物通量分布。為了深入分析電流刺激調控鈍齒棒桿菌代謝特性的原因，本研究對不同電流刺激條件下的胞內NADH/NAD＋值進行分析。由圖7 可以看出，通入電流后，鈍齒棒桿菌胞內的NADH/NAD＋值明顯升高。當電流為-2 mA與-5 mA時，NADH/NAD＋值分別為0.79與0.85，比對照組高出21.5%和30.8%。由圖1可以看出，輔因子NADH/NAD＋是6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶與乳酸脫氫酶等的輔酶，表明胞內H還原力可用水平對鈍齒棒桿菌代謝通量分布有重要的調節作用。因此，電流刺激導致鈍齒棒桿菌胞內NADH通量增加是導致鈍齒棒桿菌代謝特性發生變化及琥珀酸產量增加的主要原因之一。與本研究結果相似，其他研究也表明改變微生物培養環境可以調節其胞內NADH的可用水平，隨之調控胞內產物代謝通量分布[26]。

圖7 不同電流刺激條件下的NADH/NAD＋值Fig.7 NADH/NAD+ ratio under different electrical current stimulation conditions

除了乳酸與琥珀酸，乙酸是鈍齒棒桿菌厭氧發酵時的主要副產物。施加電流刺激后，乙酸質量濃度也呈現上升趨勢，由1.3 g/L（0 mA）增加到2.3 g/L（-5 mA），但其質量濃度與產量相對較低。

2.2 電流刺激對代謝通量分布的影響

NADH（或NADPH）主要由EMP與HMP產生。與EMP相比，1 分子葡萄糖經由HMP代謝后會產生額外2 分子H還原力（圖1）。本研究中，施加電流刺激后，消耗單位葡萄糖產生的NADH明顯增加，表明胞內EMP與HMP兩個途徑的代謝通量分布在施加電流刺激后發生改變。另外，磷酸烯醇式丙酮酸節點的代謝流分布對琥珀酸、乳酸產量也有重要調節作用[27]。通過代謝通量分析，可以更深入了解電流刺激對6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸等關鍵節點代謝流分布的影響，有助于通過電流刺激調控琥珀酸與乳酸生成比，實現鈍齒棒桿菌厭氧發酵聯產乳酸與琥珀酸。代謝通量分析結果如表3所示。

表3 代謝通量計算結果Table 3 Calculated metabolic flux distribution

可以看出，除琥珀酸、乳酸、乙酸等最終產物外，電流刺激對6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸等節點的代謝流分布產生了明顯影響。對照組中，6-磷酸葡萄糖節點流向6-磷酸果糖的流量J2為 92.4 mmol/（L·g·h），至6-磷酸葡萄糖酸的流量J9為7.6 mmol/（L·g·h），兩者比例為12∶1，說明碳源主要經由EMP 進行代謝。同時，在磷酸烯醇式丙酮酸節點，流向丙酮酸的流量J7為159.7 mmol/（L·g·h），流向草酰乙酸（C4途徑）的流量J22為37.7 mmol/（L·g·h），兩者比例約為4:1，說明碳代謝流主要流向丙酮酸-乳酸合成途徑。施加-2 mA與-5 mA電流刺激后，J9分別增加到14.0、19.7 mmol/（L·g·h），與對照組相比，分別增加了84.4%和150.6%。同時，J7流量由 159.7 mmol/（L·g·h）減少到146.9、134.2 mmol/（L·g·h）。相比之下，J22由37.7 mmol/（L·g·h）增加到48.4、59.3 mmol/（L·g·h）。以上結果說明，施加電流刺激可以明顯增加HMP與C4途徑的代謝通量。其原因可能是：微生物胞內的氧化還原態勢處于一個動態平衡狀態，在鈍齒棒桿菌胞內H還原力因外界環境改變而升高后，微生物會調節胞內的代謝產物組成，以合成還原態勢更高的代謝產物，如琥珀酸，讓NAD＋快速重生，使胞內氧化還原態勢處于新的穩定狀態[7,28]。

2.3 電流刺激對基因表達水平的影響

為進一步明確電流刺激對鈍齒棒桿菌代謝通量分布影響，本研究對關鍵酶基因的表達水平進行了分析。由圖8可以看出，施加-5 mA電流刺激后，6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因（zwf）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pepc）與蘋果酸脫氫酶基因（mdh）的表達水平均上調，而乳酸脫氫酶基因（ldhA）表達水平下調。zwf與pepc表達水平上調，可以進一步佐證電流刺激可以增加HMP與C4途徑代謝通量的結果。蘋果酸脫氫酶是琥珀酸合成途徑中的關鍵酶，NADH是其輔酶[29]。mdh表達水平上調，ldhA表達水平下調，說明C4途徑中草酰乙酸至蘋果酸的代謝活動增加，丙酮酸至乳酸的代謝活動下降，與琥珀酸產量增加、乳酸產量減少的發酵結果一致。

圖8 不同電流刺激條件下的基因表達水平Fig.8 Gene expression levels under different electrical current stimulation conditions

厭氧條件下，鈍齒棒桿菌利用C4途徑合成1 mol琥珀酸，需要2 mol NADH。EMP產生的NADH無法滿足高琥珀酸合成通量對NADH的需求，而HMP則可產生更多的H還原力。在本研究中，施加電流刺激后，陰極發生還原反應產生電子，甚至析氫，并經過傳遞鏈進入鈍齒棒桿菌胞內，電流刺激提供的額外電子致使6-磷酸葡萄糖節點處的HMP代謝通量增加，并合成更多的H還原力，結果導致胞內的NADH/NAD＋值顯著升高[25]。因為胞內可用于合成琥珀酸的NADH增加，鈍齒棒桿菌調節了磷酸烯醇式丙酮酸節點的代謝流分布，使琥珀酸合成途徑代謝通量增加，這可能就是施加電流刺激后，琥珀酸產量增加的主要原因。因此，6-磷酸葡萄糖是影響琥珀酸產量的關鍵節點，只有該節點出的代謝流發生改變，使更多的碳經由HMP進行代謝產生更多的H還原力，才能有效提高琥珀酸產量。

3 結論

研究電流刺激對鈍齒棒桿菌厭氧發酵特性的影響，結果顯示，施加-2 mA與-5 mA電流刺激可以提升鈍齒棒桿菌代謝葡萄糖的速率與琥珀酸的產量，有利于聯產乳酸與琥珀酸。電流刺激提供的額外電子使HMP代謝通量增加，并合成更多的H還原力，是琥珀酸產量提高的主要原因。本研究結果有利于加強發酵工程與電化學學科的交叉融合，可為利用微生物發酵工藝聯產琥珀酸及乳酸提供參考。