高通量測序分析黃酒糟制香糟自然發酵過程中微生物群落多樣性

賈 曼，楊 絮，周國燕，郭全友,*，朱 琳，鄭 堯

（1.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090）

黃酒糟是黃酒生產過程中的副產物，是黃酒成熟醪壓榨后留下的固形物[1]。以黃酒糟等為主要原料，經壓碎、過篩并與香辛料均勻混合后入壇密封，發酵后制成香糟。香糟鹵是以香糟為主要原料，通過添加天然植物香辛料、食鹽、黃酒等調味成分[2]，經配制、過濾、滅菌、灌裝等工藝開發而成的液態調味品[3]。目前，優質香糟鹵的生產常以封壇固態發酵3 a形成的香糟為原料，發酵周期長，大大影響了生產效率。此外，香糟鹵固態發酵1、2、3 a產品風味存在一定差異，而發酵食品風味的形成與發酵過程中的微生物及其代謝產物密切相關[4]，且黃酒糟發酵是在相對不受控制和自發的方式下進行，導致香糟鹵制品風味不穩定。因此，了解發酵過程中的微生物群落多樣性將有助于確保最終產品的質量，對開發發酵劑，改進發酵工藝，縮短發酵周期至關重要。

高通量測序技術代替了傳統純培養、聚合酶鏈式反應-時間溫度梯度凝膠電泳和聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳等方法[5]，可一次性對樣品中的幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，快速確定其中微生物的種類和豐度[6]，并廣泛應用于傳統發酵食品的微生物群落的宏基因組研究中[7]，如意大利臘腸[8]、泡菜[9]和豆豉[10]等。基于高通量測序對微生物多樣性與物種組成研究發現，酒糟中的細菌主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、微球菌屬（Micrococcus）等；真菌主要有酵母屬（Saccharomyces）、根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）等。Wang Xueshan等[11]采用16S rRNA擴增子測序技術分析了白酒糟中的原核生物群落，共鑒定出204 個屬，主要以乳桿菌屬和明串珠菌屬（Leuconostoc）等為主；Song Zhewei等[12]基于高通量測序技術分析醬香型白酒固態發酵過程中核心微生物群落結構與功能，發現畢赤酵母屬（Pichia）和曲霉屬等為優勢真菌群落。但是，目前關于自然發酵過程中黃酒糟微生物的研究鮮有報道，對黃酒糟發酵中微生物群落結構的復雜性、多樣性以及動態變化情況等仍缺乏全面的認識。

本研究以發酵1、2、3 a黃酒糟為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術分析不同發酵階段黃酒糟樣品微生物組成，客觀地評價微生物種類、數量及優勢菌群的變化規律，旨在為篩選功能發酵菌株和發酵條件優化等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品準備

黃酒糟取自東江酒業有限公司。其工藝主要為：黃酒糟→添加香辛料等→攪拌均勻→入壇鹽封→加蓋泥封→室外自然發酵。同時對發酵1、2、3 a黃酒糟取3 份平行，分別標記為DJ1-1～DJ1-3、DJ2-1～DJ2-3、DJ3-1～DJ3-3。樣品4 ℃貯藏，供后續分析。

1.1.2 試劑

DNA提取試劑盒 廣州美基生物科技有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase 美國NEB公司；DNA Marker 日本TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠電泳 緩沖液 美國Invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設備

2720聚合酶鏈式反應儀 美國ABI公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統 北京百晶生物技術有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取

取4 ℃中保存的黃酒糟充分破碎攪拌，取200 mg黃酒糟樣品于離心管中，使用美基DNA提取試劑盒（D6356-03）按照說明書提取總基因組DNA樣品，并在進一步分析前貯存在-20 ℃。分別用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定提取的DNA數量和質量。

1.3.2 PCR擴增及測序

對細菌兩個連續的可變區V3～V4[13]進行PCR擴增，使用正向引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和反向引物806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）[14]進行。將PCR所需的成分配制完后，在PCR儀上于98 ℃預變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于98 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到52 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃保持45 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成1 個循環。重復循環25 次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72 ℃保持5 min，使產物延伸完整，4 ℃保存。

對真菌內轉錄間隔區ITS1進行PCR擴增，使用正向引物ITS5F（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和反向引物ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）[15]進行。將PCR所需的成分配制完后，在PCR儀上于98 ℃預變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于98 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到52 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃保持1 min，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環。重復循環28 次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72 ℃保持5 min，使產物延伸完整，4 ℃保存。

擴增結果進行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。委托上海派森諾生物科技有限公司Illumina MiSeq平臺進行雙端 測序。

1.4 數據分析

采用Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端（Pairedend）測序，使用分析軟件QIIME2（2019.4）并調用qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后通過qiime dada2 denoise-paired調用DADA2進行質控、去噪、拼接、去嵌合體[16]，相當于以100%相似度聚類。完成對所有文庫的去噪后，合并擴增序列變體（amplicon sequence variant，ASV）的特征序列和ASV表格，并去除singletons ASVs；序列長度分布統計使用R語言腳本，對全部樣本中所包含的高質量序列的長度分布進行統計。利用OriginPro 2022和Excel 2019軟件工具繪制各分類水平下的微生物多樣性群落結構圖，對各樣本在不同分類水平上的群落結構進行分析。

2 結果與分析

2.1 α多樣性分析

α多樣性反映了單個樣品內部物種的多樣性，根據100%相似性水平下的ASV信息，采用α多樣性指標的覆蓋率、ASV數量、Chao1指數、Shannon指數與Simpson指數對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。

表1顯示，3 個發酵階段樣品的覆蓋率均在99.95%以上，表明測序數據能夠覆蓋樣品中細菌及真菌的種類，真實反映樣品中物種豐度及多樣性；如圖1所示，稀釋曲線平緩，說明測序深度較好，測序數據量合理[17]。結果顯示，無論細菌還是真菌，發酵初期ASV數量和Chao1指數均最低，即物種豐度最低。發酵初期組內樣品細菌Chao1指數差異大，變化范圍為613.91～1017.90，均值為882，發酵中期和后期Chao1指數均值為1213和1201，物種豐度呈現向上升后穩定的趨勢，發酵中后期Chao1指數的浮動趨勢不大，表明樣品中的微生物在逐漸適應生長環境，物種豐度趨于平穩。發酵過程中，細菌Shannon指數分別為6.39、6.14和6.55，Simpson指數變化范圍為0.93～0.95；真菌的Shannon指數分別為6.71、6.88和6.62，Simpson指數變化范圍為0.97～0.99，多樣性指數無明顯變化，表明黃酒糟固態自然發酵過程微生物群落結構較穩定，群落復雜度不變。

圖1 高通量測序中細菌（A）和真菌（B）的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria (A) and fungi (B) in high-through sequencing

2.2 微生物物種組成分析

2.2.1 基于門水平的發酵黃酒糟菌群結構分析

根據得到的每個ASV在門分類水平的物種分類信息，分析樣本ASV在門分類水平上的群落結果。由圖2可知，3 組發酵黃酒糟樣品中細菌及真菌微生物群落組成相似，但相對豐度存在差異。在門水平下，發酵黃酒糟樣品一共鑒定出31 個細菌物種，圖2A顯示豐度水平前10的物種。發酵黃酒糟中細菌優勢菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）。羅愛國等[18]基于門水平對清香型堡子酒酒糟樣品中的細菌菌群進行分析，同樣發現這4 個菌門為細菌優勢門，與本研究結果一致。變形菌門是黃酒糟發酵整個過程中的絕對優勢菌門，發酵第1年其平均相對豐度為71.26%，整個發酵過程，其相對豐度變化不大，發酵第2年相對豐度上升至75.27%，于發酵第3年下降至73.22%。這可能是由于變形菌門的一部分細菌為好氧型，不能適應黃酒糟發酵過程中缺氧、產酸、產醇的環境，因而在發酵第3年豐度降低。厚壁菌門在發酵第1年時占較高比例（16.09%），隨發酵進行其相對豐度逐漸降低并趨于穩定。擬桿菌門在黃酒糟發酵過程中呈現小幅度先上升后下降的趨勢，在黃酒糟發酵第2年相對豐度達到最高（6.82%）。放線菌門在黃酒糟發酵過程中呈現逐漸上升的趨勢，在發酵第3年相對豐度達到最高（5.78%）。

圖2 發酵黃酒糟中細菌（A）和真菌（B）門水平的群落分類學 組成和相對豐度分布Fig.2 Phylum-level composition and abundance distribution of bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented huangjiu vinasse

在門水平下，發酵黃酒糟樣品共鑒定出10 個真菌物種。如圖2B所示，發酵黃酒糟中主要真菌優勢菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和蛙糞霉門（Basidiobolomycota）。子囊菌門是黃酒糟發酵整個過程中的絕對優勢菌門，發酵過程中，其相對豐度分別為63.46%、58.07%、51.68%，呈現逐年下降的趨勢。陳雪等[19]利用高通量測序技術分析鳳香型白酒發酵過程中微生物群落結構及演替規律，發現整個發酵過程中子囊菌門占絕對優勢，與本研究結果一致。擔子菌門在發酵過程中呈現先上升后下降的趨勢，在發酵第2年其相對豐度達到最高（16.23%）。被孢霉門在發酵第1、2年相對豐度較接近，呈現輕微下降趨勢，在發酵第3年相對豐度下降至3.10%。蛙糞霉門在黃酒糟發酵第1、2年相對豐度接近，分別為1.47%、1.56%，在發酵第3年其相對豐度下降至0.35%。有研究表明，子囊菌門、擔子菌門等是多種發酵食品中的主要真菌種群[20]。

2.2.2 基于屬水平的發酵黃酒糟菌群結構與熱圖分析

根據得到的每個ASV在屬分類水平的物種分類信息，分析樣本ASV在屬分類水平上的群落結果。在屬水平下，發酵黃酒糟樣品共鑒定出944 個細菌物種，315 個真菌物種。3 組發酵黃酒糟樣品中細菌及真菌微生物群落組成相似，但相對豐度存在差異。由圖3A可知，黃酒糟發酵過程中排前10的細菌屬分別為水小桿菌屬（Aquabacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、柄桿菌屬（Caulobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）、不黏桿菌屬（Asticcacaulis）、Muribaculaceae、Inhella、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospriaceae_NK4A136_group）、芽孢桿菌屬（Bacillus）。發酵初期，以水小桿菌屬為優勢細菌屬，在發酵過程中由22.48%升高到24.94%，發酵結束時恢復到21.29%，仍為優勢屬；且由圖3B可知，水小桿菌屬于DJ2-3與DJ3-2相對豐度最高，分別為26.52%與25.93%，水小桿菌發酵可產生聚β-羥基丁酸酯，積聚在細菌體內，作為碳源和能源的儲備物質[21]。短波單胞菌屬隨著發酵時間延長相對豐度呈現逐年下降的趨勢；由圖3B可知，與其他發酵階段相比，慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和芽孢桿菌屬在發酵末期相對豐度較高，如DJ3-1與DJ3-3樣品中慢生根瘤菌屬相對豐度為1.15%與0.95%；芽孢桿菌相對豐度為2.33%與2.35%。芽孢桿菌能影響白酒的風味物質如酯、醇的形成[22-23]；同時，乳桿菌屬在發酵中期相對豐度最高，在DJ2-2與DJ2-3樣品中相對豐度分別為1.60%與1.89%，在發酵第3年其相對豐度降低至0.64%，乳桿菌屬與乳酸乙酯的形成具有密切關系[24]，其對于有機酸具有一定的耐受能力[25]，能減弱酵母菌的好氧代謝速度，延長前發酵期，有利于發酵有益菌的生長，對香味物質增加有利[26-27]。

圖3 發酵黃酒糟中細菌屬水平的群落分類學組成（A）和熱圖（B）Fig.3 Genus-level composition (A) and heatmap (B) of bacterial communities in fermented huangjiu vinasse

由圖4A可知，黃酒糟發酵過程中排前10的真菌屬分別為畢赤酵母屬（Pichia）、Tausonia、被孢霉屬（Mortierella）、曲霉屬（Aspergillus）、裂殼菌屬（Schizothecium）、尖孢鐮刀菌屬（Fusarium）、亞隔孢殼屬（Didymella）、外瓶霉屬（Exophiala）、Phialemoniopsis、Tetracladium。劉念等[28]在對濃香型白酒糟醅微生物研究中發現，酵母屬、曲霉屬等是濃香型白酒糟醅中的主要優勢菌。研究表明酵母類真菌在產香、產酒等方面具有較強作用[29]，能夠產生多種風味酯并貢獻乙醇和其他有機酸[30-31]。結果顯示，畢赤酵母在整個發酵過程中占絕對優勢，結合圖4B可知，其在發酵末期相對豐度最高，在DJ3-2與DJ3-3樣品中相對豐度分別為18.43%與17.41%。畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源[32]，發酵過程中，原料的植物細胞壁及細胞間質的果膠被水解成甲醇，隨著發酵過程的積累，發酵后期畢赤酵母豐度達到最高；畢赤酵母具有高產乙酸乙酯的特性，同時是乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的第2大生產者[33]，能促進發酵過程中揮發性化合物的產生，增強產品的香氣特征。另外，發酵中期DJ2-2樣品中Tausonia、亞隔孢殼屬、曲霉屬與球腔菌屬（Mycosphaerella）相對豐度較其他發酵階段高，分別為9.94%、4.21%、9.38%與2.77%。曲霉屬能夠產生淀粉酶、蛋白酶等，是黃酒糟發酵中淀粉等大分子物質分解的主要動力之一[34-35]。被孢霉屬與裂殼菌屬在發酵過程中相對豐度呈現逐年下降的趨勢，在發酵第3年相對豐度均達到最低值，分別為3.10%、1.55%；發酵末期DJ3-1樣品中，外瓶霉屬、Knufia和雙足囊菌屬（Dipodascus）相對豐度較高，分別為8.81%、4.17%與2.78%。以上結果表明，黃酒糟同一批次不同樣品間存在差異，表明了固態自然發酵過程的不均一性。

圖4 發酵黃酒糟中真菌屬水平的群落分類學組成（A）和熱圖（B）Fig.4 Genus-level composition (A) and heatmap (B) of fungal communities in fermented huangjiu vinasse

同時，由屬水平的菌群結構可以看出，無論是細菌還是真菌，菌群結構都十分復雜。發酵過程中產生的風味物質與微生物的生長和代謝密切相關[36]。這些微生物催化原料不斷進行一系列復雜的反應，可以分解原料中的淀粉、蛋白質，形成糖和氨基酸，從而引發美拉德反應，生成黃酒糟獨特的風味前體物質；能夠將蛋白質分解為小分子肽，并形成重要的香氣成分，例如醛、醇、酯、酮等，進而形成糟鹵清爽醇厚的風格特征[37-39]。

2.3 β多樣性分析

通過β多樣性分析黃酒糟制香糟發酵過程中微生物群落組成的差異性，基于Bray-Curtis距離算法對所有樣品進行非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析，不同樣品間的差異程度，通過點與點的距離表現在圖中，兩點之間的距離越遠，表明兩個樣品中微生物群落的差異越大[40]，結果如圖5所示。對細菌群落測序結果進行排序分析，其stress值為 0.092＜0.1，排序結果良好。從圖5A可知，發酵第2年與發酵第3年樣品均分布在1、4象限，而發酵第1年樣品獨自分布在第2、3象限，表明發酵第1年樣品的細菌屬組成與其他樣品具有較大差異，綜合α多樣性和菌群結構分析可知，此種差異主要來源于細菌的相對豐度改變。真菌群落的NMDS分析結果如圖5B所示，其stress值為 0.075＜0.1，排序結果良好。其中發酵第1年與發酵第2年樣品均分布在第2、3象限，表明這兩年的樣品間具有一定相似性，且與發酵第3年樣品距離較遠，可能是由于發酵過程中產生的酸類及醇類等物質的累積，不適于某些真菌的生長繁殖，導致發酵第3年與發酵前兩年的真菌群落結構具有明顯差異[41]。

圖5 微生物群落的NMDS分析 Fig.5 NMDS analysis of microbial communities in fermented huangjiu vinasse

3 結論

采用高通量測序分析黃酒糟固態自然發酵階段細菌及真菌群落變化情況，黃酒糟微生物群落的多樣性指數、分類學組成的變化和聚類分析等表明，黃酒糟發酵過程中微生物群落結構復雜多樣。其中，水小桿菌屬、短波單胞菌屬、柄桿菌屬為優勢細菌屬，這些菌屬在其他酒糟中的相關報道較少，這表明微生物結構與發酵原料、發酵工藝、地理位置和發酵環境有很大的關系。其中芽孢桿菌屬與乳桿菌屬相對豐度位居前13 位，但對整個發酵過程起著不可忽視的作用。畢赤酵母、Tausonia、被孢霉屬和曲霉屬為優勢真菌屬。綜上，黃酒糟發酵不同階段的微生物群落存在差異，且發酵過程對微生物相對豐度具有明顯影響，為進一步研究黃酒糟的發酵代謝機理及菌株篩選奠定了基礎。