橡木片陳釀對柿白蘭地風味的影響

李佳敏，孫金旭，王紫娟，袁 野，朱會霞，聶馨玙，劉可昕，張一凡，敖常偉,,

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北省果蔬發酵技術創新中心，河北 衡水 053000；3.河北農業大學園藝學院，河北 保定 071000）

柿（Diospyros kakiThunb.）屬于柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros）植物[1]，我國有著悠久的柿樹栽培歷史，是我國的特色果樹[2-3]。目前，我國仍是世界上主要的柿子生產國和消費國，柿樹栽培地域廣泛，柿品種豐富多樣[4]。磨盤柿是極具優勢的澀柿品種，起源于北京房山區，一般采收期為10月下旬至11月，其皮薄肉厚，果大多汁，單果質量平均為230 g，最高的可以達到500 g，北京房山區、天津薊縣以及河北易縣和滿城區均被授予“中國磨盤柿之鄉”的稱號。柿果實營養豐富，含有多糖、維生素、氨基酸、果膠、有機酸等營養物質，以及黃酮類、多酚類等活性物質[5-7]。但柿具有季節性、地域性強和不耐貯存的特點[8]，長期貯藏與運輸的成本較高，導致大量柿果實棄而不摘，柿資源利用不充分。因此柿果深加工是柿資源多元化利用的發展方向之一。

白蘭地是以水果為原料，經發酵、蒸餾、陳釀而成的蒸餾酒[9]，具有獨特的香氣。作為世界六大蒸餾酒之一，白蘭地有著十分廣闊的消費市場，尤其近年來，白蘭地市場增幅明顯，有關柿子白蘭地釀造工藝的報道也開始不斷增多。在這些報道中，劉靜等[10]測定柿白蘭地原液的香氣成分，發現柿白蘭地中主要香氣成分為酯類和醇類。白蘭地原液在調配后，普遍貯藏于橡木桶中進行陳釀，以改善白蘭地酒體的風味[11]，但橡木桶的使用提高了白蘭地的生產成本。首先，橡木桶對于其板材原料、制作工藝的要求相對較高，因此會使板材得不到充分的利用，且橡木木質緊密，白蘭地原液僅能與橡木板的表面發生物理和化學反應，深層木板則無法得到利用，當木板表面成分日趨貧瘠，橡木桶也隨之失去 作用[12]。鑒于此，研究者開發了不同的橡木制品以期代替橡木桶在柿白蘭地釀造中的使用，橡木片即為其中較常使用的一種橡木制品[13]，橡木片主要選用樹的不用部位，自然風干18 個月，經過物理、化學、生物等方法處理，烘烤加工制成，主要有輕度烘烤、中度烘烤和重度烘烤3 種烘烤方式。比起橡木桶，橡木片具有更大的靈活性，其烘烤程度，加工方式都比橡木桶更易控制，橡木片的有效成分更豐富，口感更純凈，橡木片陳釀的白蘭地成本更低，操作更簡單，且與酒體接觸面積大，也可以使白蘭地得到較好的品質。

本實驗以磨盤柿為原料釀造柿白蘭地，在柿白蘭地原液中添加不同量的橡木片進行陳釀，對陳釀后的柿白蘭地進行揮發性成分、非揮發性成分、總酚及抗氧化性的檢測，并進行感官評定，分析添加不同量橡木片陳釀后的柿白蘭地中各成分的變化，探究橡木片對柿白蘭地品質的影響，以期為柿白蘭地的研究和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磨盤柿：2020年采摘于河北省保定市滿城柿子溝。

3-辛醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉、碳酸鈉（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；福林-酚（分析純）上海索寶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；國產中度烘烤橡木片 日照紅上實業有限公司。

1.2 儀器與設備

12L蒸餾鍋 煙臺帝伯仕有限公司；酒精計 河北 天天玻璃儀表廠；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；7890B-5977A型氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國Agilent Technologies公司；Vanquish Horizon system-Q-Exactive型高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）聯用儀 美國賽默飛公司；SYG-2數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 柿白蘭地工藝流程

磨盤柿→清洗→打漿→發酵→蒸餾→調配乙醇體積分數為42%→添加橡木片→陳釀→成品

1.3.2 操作過程

在蒸餾過程中，截取乙醇體積分數為30%～60%的餾出物，調配至乙醇體積分數為42%作為柿白蘭地原液，采用浸泡方式以5、10、15、20 g/L的比例加入國產中度烘烤橡木片進行陳釀。

1.3.3 柿白蘭地揮發性成分測定

在柿白蘭地對橡木片的萃取基本完全后，選取陳釀時間為210 d的柿白蘭地進行揮發性成分檢測。

選用頂空固相微萃取法，對樣品進行揮發性成分的萃取，取5 mL柿白蘭地樣品于20 mL頂空瓶中，加入2.5 μL 3-辛醇為內標，再加入1.5 g氯化鈉，置于50 ℃水浴鍋中平衡20 min，后繼續置于50 ℃水浴鍋，萃取20 min，每個樣品做3 次平行處理。

GC條件：HP-Innowax色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min升至100 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min[14]。載氣為He（純度99.999%），進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，分流比5∶1。

MS 條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離電壓70 eV；質量掃描范圍m/z33～350。

定性分析：用NIST 14.L標準譜庫檢索，并且查閱相關文獻資料進行定性，選擇匹配度大于80%的組分進行分析。

定量分析：采用內標法進行定量分析，按下式計算：

式中：Xi為待測樣品的質量濃度/（mg/L）；Cs為內標物的質量濃度/（mg/L）；Ai為待測樣品的峰面積；As為內標物的峰面積。

1.3.4 柿白蘭地非揮發性成分測定

在柿白蘭地對橡木片的萃取基本完全后，選取陳釀210 d的柿白蘭地進行非揮發性成分檢測。

取200 μL 待測樣品，加入800 μL 甲醇-乙腈（1∶1，V/V）且含0.02 mg/mLL-2-氯苯丙氨酸（內標）的提取液，混勻，在5 ℃超聲提取30 min；將待測樣品在-20 ℃靜置30 min后離心15 min，取上清液用氮氣吹干；加入120 μL乙腈-水（1∶1，V/V）進行復溶，混勻，5 ℃超聲萃取5 min，離心10 min，取上清液上機進行檢測分析；另外分別取各個樣本上清液20 μL進行混合，作為質控樣本。

LC 條件：ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A：95%水＋5%乙腈（含0.1%甲酸）；流動相B：47.5%乙腈＋47.5%異丙醇＋5%水（含0.1%甲酸）；流速0.40 mL/min，進樣量2 μL，柱溫40 ℃。

MS條件：電噴霧電離源；正、負離子掃描模式采集質譜信號；加熱溫度400 ℃；毛細管溫度320 ℃。

1.3.5 總酚含量及DPPH自由基清除率的測定

參照Lu Yao等[15]的方法進行總酚含量的測定。以沒食子酸繪制標準曲線，吸取1.0 mL樣品，分別加入5.0 mL水，1.0 mL福林-酚溶液和3.0 mL碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h后，以標準曲線0.0 mg/L為空白，在765 nm波長下測定樣品溶液的吸光度，每個樣品做3 次平行處理。

參照夏亞男等[16]的方法進行DPPH自由基清除率的測定。吸取1 mL樣品加入2 mL DPPH自由基乙醇溶液，混勻，避光放置30 min，在517 nm波長處測吸光度為A1，用1 mL無水乙醇代替DPPH自由基乙醇溶液，測定吸光度為A2，取1 mL無水乙醇加入2 mL DPPH自由基乙醇溶液，測定吸光度為A0。每個樣品做3 次平行處理。

1.3.6 感官評價

選取10 名品評員，分別從外觀、色澤、香氣、口味、典型風格等方面對添加不同量橡木片陳釀的柿白蘭地進行感官評價，標準如表1所示。

表1 柿白蘭地感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of persimmon brandy

1.4 數據處理

采用SPSS 25.0對實驗數據進行方差、顯著性分析及主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 柿白蘭地揮發性成分分析

2.1.1 柿白蘭地揮發性成分

揮發性成分的種類和含量是評價白蘭地品質的重要一個指標，因此，用GC-MS對不同橡木片添加量陳釀的柿子白蘭地進行揮發性成分分析。如表2所示，在柿白蘭地中共檢測到33 種揮發性成分，其中酯類有17 種，分別為乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、苯甲酸甲酯、癸酸乙酯、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、辛乙烯二醇單正十二烷基酯、順-9-十六碳烯酸乙酯；醇類有4 種，分別為丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇；酸類有4 種，分別為乙酸、辛酸、正癸酸、月桂酸；醛酮類有5 種，分別為乙醛、壬醛、糠醛、5-甲基呋喃醛、反式-3-戊烯-2-酮；其他物質有3 種，分別為2,4-二叔丁基苯酚、萘、Ethyl 9-tetradecenoate。可以看出，無論陳釀時是否添加橡木片，柿白蘭地中主要呈香氣物質為酯類，尤其以乙酸乙酯、辛酸乙酯豐度較高，對柿白蘭地風味的形成有重要貢獻。

表2 不同橡木片添加量條件下陳釀210 d的柿白蘭地揮發性 成分的分析結果Table 2 Concentrations and flavor description of volatile components in persimmon brandy aged for 210 days with the addition of different amounts of oak chips

2.1.2 橡木片陳釀對揮發性成分的影響

感官上，隨著橡木片的添加量增加，柿白蘭地香氣逐漸濃郁，揮發性成分的種類與豐度檢測幫助解釋了風味變化的原因。主要呈香的酯類物質在添加橡木片的陳釀過程中豐度顯著提升，酯類物質主要是由有機酸與醇類物質在發酵與陳釀過程中發生反應所生成的[17-18]。陳釀過程中添加橡木片能夠顯著提升柿白蘭地中的酯類物質的豐度，由表3可知，未添加橡木片柿白蘭地陳釀210 d后，酯類物質17 種，總質量濃度為1.31 mg/L，陳釀過程中添加5、10、15 g/L及20 g/L橡木片的柿白蘭地中，酯類物質種類數量差異極小，而總體含量卻有明顯提升，其原因為陳釀過程中，橡木片浸出的物質發生氧化生成有機酸類，而有機酸又會與醇類發生反應生成酯類[19]。4 個不同橡木片添加量的柿白蘭地在陳釀210 d后酯類質量濃度分別升高了2.05、3.63、3.86 mg/L和4.16 mg/L。酯類總體含量的提升主要受益于乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量的提高，它們大多提供了豐富的花香和果香。

表3 柿白蘭地中各類物質數量及含量Table 3 Types and concentrations of volatile compounds in persimmon brandy

醇類物質大多也是在發酵中產生，主要是酵母在厭氧環境中發生氨基酸脫氨基反應，或在有氧環境下發生糖脫羧反應，將氨基酸進行轉化而成[17-18]，在一定的比例下，醇可以對白蘭地的風味產生積極影響。陳釀過程中少量添加橡木片提高了柿白蘭地中醇類物質的含量，原因為由橡木片溶出的醛酮類物質發生反應被還原為醇類。在5 g/L和10 g/L橡木片陳釀白蘭地中，醇類質量濃度由0.44 mg/L提升至0.74 mg/L和1.81 mg/L，而添加量增至15 g/L和20 g/L，醇類的總含量有所降低，降至0.65 mg/L 和0.90 mg/L。從具體成分看，柿白蘭地揮發性氣體中主要成分為異戊醇，占比達到80%以上，橡木片的添加對異戊醇含量的影響也決定了總醇類含量的變化。

大部分有機酸是在發酵過程中形成的[18]，在陳釀過程中由醇類轉化而成的醛類物質氧化后又能轉化為酸類物質，導致酸類物質含量的增加，而有機酸與醇類的反應又導致了酸類物質的消耗[20]。本實驗中，不同橡木片添加量柿白蘭地的揮發性物質中，酸類總體含量并不穩定。醛酮類物質主要有乙醛、壬醛和糠醛，在加入橡木片后壬醛和糠醛的含量有小幅度提升。

為了能夠進一步探究柿白蘭地中的主要揮發性成分，運用SPSS Statistics 25進行PCA，結果如表4所示，提取出4 個PC，累計貢獻率為100%。PC1中貢獻較大的揮發性成分有乙酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、正癸酸、十四酸乙酯等；PC2中貢獻較大的有乙酸異戊酯、辛酸、月桂酸等。

表4 柿白蘭地主成分總方差解釋Table 4 Total variance explained by first four principal components in persimmon brandy

陳釀時添加橡木片能夠明顯提高原柿白蘭地中的揮發性香氣成分。橡木片與橡木桶的制作工藝類似，所添加的橡木片也需要經過烘烤之后才能使用，烘烤過程對橡木中的化學成分有重要的影響，在烘烤過程中，橡木木質素、多糖等受熱降解，而呋喃、酚類等新物質出現，這些化學成分在白蘭地陳釀過程中被酒體吸收，改變了酒體風味[21-23]。柿白蘭地中主要香氣物質仍然是由醇和有機酸反應生成的酯類物質，包括乙酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯。

2.2 柿白蘭地非揮發性成分分析

2.2.1 柿白蘭地非揮發性成分

為明確陳釀時加入橡木片對柿白蘭地中活性物質的影響，利用LC-MS對陳釀210 d后的柿白蘭地進行檢測。如表5所示，全部樣品在正離子模式下檢測到質譜峰數7349 個，負離子模式下檢測到質譜峰數6070 個，其中通過一、二級質譜數據，于自建庫、Metlin、HMDB等代謝物數據庫中注釋到非揮發性物質388 個（正離子模式）和230 個（負離子模式）。對樣品中的非揮發性物質進行PCA，由圖1可知，加入橡木片的柿白蘭地樣本較為聚集，且與未加橡木片白蘭地距離較遠，說明添加橡木片的柿白蘭地中代謝物種類或者豐度與對照組有較大的差別，且橡木片添加量越高對陳釀的效果影響越大。

圖1 陳釀210 d柿白蘭地PCA得分圖Fig.1 PCA score plots of non-volatile compounds in persimmon brandy aged for 210 days

表5 陳釀210 d柿白蘭地中非揮發性物質數量統計Table 5 Statistics of the number of non-volatile substances in persimmon brandy aged for 210 days

2.2.2 橡木片陳釀對非揮發性成分的影響

進一步比較處理組和對照組差異非揮發性物質種類可以發現（表6），隨著橡木片添加量的提高，差異非揮發性物質種類也隨之增加，添加量為5、10 g/L和15 g/L 時，處理組與對照組中非揮發性物質種類差異依次達到207、267 種和295 種。由圖2可以看出，有12 種非揮發性物質在添加橡木片的處理組中消失，它們可能作為前體同橡木片浸提物發生反應而被消耗。與之相比，有更多的非揮發性物質在各添加量的柿白蘭地中均有出現，新增物質種類有183 種，根據HMDB數據庫，將這些新增非揮發性物質分為21 類，其中異戊烯醇酯類最多，有40 種，有機氧化合物有30 種，黃酮類有20 種，羧酸及其衍生物有13 種，脂肪酰基有3 種，類固醇及其衍生物有8 種，香豆素及其衍生物有7 種，苯并吡喃、單寧有6 種，肉桂酸及其衍生物有4 種，嘌呤核苷有3 種，2-芳基苯并呋喃黃酮類化合物、唑系、二氫呋喃、甘油酯類、吲哚及其衍生物、異香豆素及其衍生物、酚類、嘧啶核苷均有2 種，氮雜菲酮類有1 種、其他有16 種。如表7所示，非揮發性成分中部分物質的相對豐度隨著橡木片添加量的增加而增加，如山茶花素A、靈芝酸、Castacrenin C等；而部分物質的相對豐度則出現先上升后下降的趨勢，在橡木片添加量為10 g/L時相對豐度最高，如葡萄糖苷、Castacrenin E等。橡木片的添加豐富了柿白蘭地中非揮發性成分的種類與豐度，新增的非揮發性成分中不乏有益物質，如靈芝酸在抑癌、防治心血管疾病、保護肝臟和防治癲癇方面具有一定作用[24]；綠原酸具有抗氧化、預防心血管疾病、降低血漿和肝臟脂質及改善礦物質分布的功能；茶花素A具有抗氧化活性，并能夠抑制腫瘤增殖；根皮苷具有降血糖血脂、急性肝損傷保護作用。

圖2 陳釀210 d柿白蘭地Venn圖Fig.2 Venn diagrams of non-volatile compounds in persimmon brandy aged for 210 days

表6 陳釀210 d柿白蘭地中的差異非揮發性物質數量Table 6 Number of differential non-volatile compounds in persimmon brandy aged for 210 days

表7 陳釀210 d柿白蘭地中部分非揮發性物質Table 7 Relative abundance of non-volatile substances in persimmon brandy aged for 210 days

2.3 柿白蘭地總酚和抗氧化能力

如表8所示，加入橡木片陳釀的柿白蘭地中，總酚含量顯著增加，且總酚含量隨橡木片添加量的增加而增加。90 d是柿白蘭地浸提橡木片中多酚物質的關鍵時間點，橡木片添加量為5 g/L和10 g/L的柿白蘭地在陳釀90 d時總酚含量達到最高，橡木片添加量為15 g/L的柿白蘭地同樣在陳釀90 d時總酚含量趨于穩定，而未添加橡木片的柿白蘭地在同樣的陳釀時間內總酚含量穩定在10 mg/L左右。此外，如表9所示，加入橡木片陳釀的柿白蘭地具有更強的DPPH自由基清除能力，且DPPH自由基清除能力隨橡木片添加量的增加而上升。柿白蘭地的DPPH自由基清除能力變化與多酚含量變化類似，橡木片添加量為5 g/L 的柿白蘭地在陳釀90 d時對DPPH自由基的清除能力達到最高值，隨后下降，而添加量為10 g/L和15 g/L的柿白蘭地在陳釀90 d后對DPPH自由基的清除能力趨于穩定。

表8 陳釀210 d柿白蘭地總酚含量Table 8 Content of total phenols in persimmon brandy aged for up to 210 days mg/L

表9 陳釀210 d柿白蘭地DPPH自由基清除率Table 9 DPPH radical scavenging capacity of persimmon brandy aged for up to 210 days%

在傳統橡木桶陳釀方法中，其主要目的之一為將酚類物質從橡木中萃取出來，并且氧氣分子能夠通過橡木桶結構中的微孔進行滲透和擴散，因此可以使白蘭地發生氧化作用，萃取出的酚類物質能夠使原白蘭地呈現金黃且透明的顏色[25-27]。從實驗結果看，使用橡木片代替橡木桶能夠達到與橡木桶陳釀相近的結果，但是陳釀周期明顯縮短。橡木桶陳釀白蘭地往往需要數年的時間，與之相比，本研究中，加入橡木片的柿原白蘭地在陳釀90 d后，柿白蘭地中總酚含量便達到最高。橡木片縮短陳釀周期的原因在于，相較于橡木桶，橡木片與柿白蘭地的接觸面積更大，萃取效率高。

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。表9同。

2.4 柿白蘭地感官評價

分別從外觀、色澤、香氣、口味和典型風格對添加不同量橡木片陳釀的柿白蘭地進行感官評價。如表10所示，柿白蘭地的澄清度評分均高于8 分，說明柿白蘭地酒體有光澤，無懸浮物和沉淀物。但橡木片添加量為0 g/L 的柿白蘭地的色澤、香氣、口味、典型風格分數相對較低，感官評價總分分別為45.5、58.8、69.8和72.5。橡木片添加量為10 g/L和15 g/L陳釀的柿白蘭地澄清透明，色澤金黃，有明顯的橡木香及酒香，香氣協調，品嘗起來酒體醇和豐滿，回味悠長，具有較典型的柿白蘭地特征，感官評分最高為72.5。

表10 柿白蘭地感官評分Table 10 Sensory evaluation results

實際上，歐盟法規(CE)第2165/2005號和(CE)第1507/2006號批準，這些法規定義了葡萄酒中橡木碎片的使用方式，但目前，高品質的白蘭地仍然必須利用橡木桶進行陳釀獲得[28]，不能僅通過浸泡橡木制品，所以橡木片在柿白蘭地陳釀時的應用仍然需要進一步的探索以提高白蘭地品質。不同產地的橡木同樣會對白蘭地的品質產生影響[29]，目前，葡萄酒中使用的橡木制品大多來自于法國橡木和美國橡木[30]。此外，橡木的風干時間及方法、橡木品種等因素也會影響揮發性香氣成分。可見，通過橡木片改善柿白蘭地風味的方法并不局限于本研究所使用的方法，可以通過變換橡木片的類型優化柿白蘭地的品質。

3 結論

利用GC-MS對橡木片陳釀的柿白蘭地中揮發性成分進行檢測與分析，共檢測到33 種揮發性成分，主要成分為酯類物質，包括乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等，這些酯類物質大多呈花果香氣，在橡木片添加量為 10 g/L時，柿白蘭地中的揮發性成分含量最高；利用LC-MS對柿白蘭地中的非揮發性成分進行檢測與分析，發現柿白蘭地中非揮發性成分種類豐富，經橡木片陳釀的柿白蘭地中，非揮發性物質種類及含量顯著增加，共檢測出183 種、21 類差異代謝物，橡木片中被萃取到酒體中的物質大多數都隨橡木片添加量的增加而增加，且對柿白蘭地的品質具有積極影響，它們不僅能提供多樣的味道使柿白蘭地的風味更為豐富，還能提高柿白蘭地的功能性作用。橡木片陳釀對柿白蘭地中酚類物質以及抗氧化能力均有積極影響，均隨著橡木片添加量的增加而增加，陳釀90 d時基本達到平衡；在感官評價中，橡木片添加量為15 g/L時評分最高，為72.5。本實驗為橡木片在柿白蘭地中的應用提供了理論基礎。