發酵型和配制型山楂酒中主要呈香物質組成分析

谷佩珊，陳亦新，王春光，朱雨萱，常曉敏，王思思，朱保慶,，汪厚銀,

（1.北京林業大學生物科學與技術學院，林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；2.中國標準化研究院農業食品標準化研究所，北京 100191）

山楂（Crataegus pinnatifidaBge.）是薔薇科山楂屬植物，在我國山東、山西、遼寧等地都有種植，是我國特有的藥食同源林果[1]。山楂果實富含營養，具有開胃健脾、降血壓、降血脂、活血化痰等功效[2]。我國山楂產量雖高，但鮮食口感較酸，因此常對其進行加工，而山楂酒因其天然的營養成分和細膩的風味作為最有發展前景的產品之一[3-5]。香氣是包括果酒在內的食品感官品質的重要方面[6]，目前關于山楂酒香氣的研究較少[7]。

氣相色譜-四極桿質譜（gas chromatographyquadrupole-mass spectrometry，GC-Quadrupole-MS）聯用法是一種鑒定果汁和果酒香氣成分的常用方法，如Lin Yanxin等[8]在6 種沼澤越橘酒中共檢測到99 種揮發性成分，92 種揮發性成分的峰面積比在樣品間存在顯著差異；龐惟俏等[9]對大興安嶺野生藍莓果酒及果汁進行分析，分別鑒定出45 種和28 種揮發性成分。氣相色譜-靜電場軌道阱質譜（gas chromatography-orbitrap-mass spectrometry，GC-Orbitrap-MS）聯用法是一種靈敏度極高的新型GC-MS技術，具有高質量分辨率（120000半峰全寬（m/z200）以及高質量精度（＜3 mg/L））的優勢，并已經應用到果酒痕量香氣組分定量研究中[10-11]。

氣相色譜嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法是一種將嗅覺儀與GC相結合的方法，與MS聯用能夠更有效地鑒定影響樣品中呈香的關鍵物質。Zhu Jiancai等[12]通過熱解吸系統結合GC-MS-O的方式對山楂果泥中的揮發性成分進行研究，并結合香氣活性值得到山楂果泥的特征香氣化合物。氣味活性值（odor active value，OAV）是香氣化合物含量與閾值的比值，通常認為單體化合物的OAV超過1則表示該化合物對樣品的整體香氣有貢獻；然而在葡萄酒等樣品中，也有學者認為OAV高于0.1的酯類化合物也具有香氣貢獻[13]。

本研究采用液液萃取-溶劑輔助風味蒸發（liquidliquid extraction-solvent assisted flavor evaporation，LLESAFE）結合GC-O-MS方法對山楂酒的特征香氣化合物進行鑒定，并計算量化強度（modified frequency，MF）值；采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction extraction，HS-SPME）對山楂酒中的揮發性成分進行提取，分別采用GC-Quadrupole-MS和GCOrbitrap-MS進行定性和定量分析，并計算化合物的OAV確定其香氣貢獻。研究山楂酒的呈香物質，對開發出品質優良、風味純正的山楂酒產品具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵型山楂酒（SBL-J）于2020年6月來自山東皇尊莊園山楂酒有限公司，乙醇體積分數為13%；配制型山楂酒（FS）來自北京豐收葡萄酒有限公司，乙醇體積分數為14%。

發酵型山楂酒（SBL-J）配料：敞口山楂汁、焦亞硫酸鉀。

配制型山楂酒（FS）配料：山楂、純凈水、食用酒精、白砂糖、紅葡萄酒、食用添加劑（檸檬酸、山梨酸鉀、焦亞硫酸鉀）。

甲醇、乙醇、二氯甲烷（均為色譜純）美國Honeywell公司；香氣標準品（色譜純）、C7～C40正構烷烴標準品、4-甲基-2-戊醇（內標）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

嗅覺儀（olfactory detection port，ODP）瑞士Brechbühler公司；SAFE裝置 德國Glasbl?serei Bahr公司；DC-12 型氮吹儀 上海安譜科學儀器有限公司；7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Aglient科技有限公司；Trace 1300氣相色譜儀、Q-exact Orbitrap質譜儀 美國Thermo Scientific公司；DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國J&W Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 感官分析

采用定量描述性分析方法，評價小組由15 名評價員組成。要求評價員嗅聞酒樣的香氣，并對討論得出的11 種香氣屬性進行強度打分，分別為山楂香、果香、甜香、蜂蜜香、酒精味、醬香、啤酒、甘草、煙熏、中藥香、花香。打分采用10 點標度法（0～9 分，0 分代表感受不到香氣，9 分代表香氣十分強烈）。

1.3.2 GC-O嗅聞分析

LLE：取樣品各100 mL，分別用50、30 mL和30 mL二氯甲烷進行3 次萃取，每次通過磁力攪拌（700 r/min）10 min。采用分液漏斗合并有機相，得到山楂酒香氣提取液。

SAFE：循環水浴及恒溫水槽溫度均設置為50 ℃，開啟分子渦輪泵，系統真空度達到1×10-6MPa時打開滴液漏斗旋塞，使其緩慢滴入圓底蒸餾瓶中。SAFE裝置收集瓶中提取液在室溫下自然融化后，加入10 g無水硫酸鈉干燥，4 ℃冰箱靜置12 h后過濾，有機相通過氮吹濃縮至500 μL，獲得揮發性成分濃縮液。

GC條件：1）HP-INNOWAX極性色譜柱（60 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣（He）流速1.5 mL/min；進樣量1 μL；不分流；升溫程序：進樣口溫度250 ℃，在柱溫50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。2）HP-5MS非極性色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（He）流速1 m L/min；進樣量1 μL；不分流；升溫程序：進樣口溫度250 ℃，柱溫40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至180 ℃，以9 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

MS條件：接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z30～550。

ODP條件：樣品經色譜柱分離后1∶1分別進入質譜和ODP進行檢測；嗅聞口溫度220 ℃；濕潤的空氣以 50 mL/min流入嗅聞口。

選取4 名（3 女1 男，22～24 歲）有嗅聞經驗的評價員組成評價小組。實驗前，對4 位評價員展開香氣識別記憶訓練，通過將49 種單體標準品配制成濃度超閾值3 倍及以上的香氣瓶[14]進行香氣識別和記憶。實驗時，4 名評價員記錄香氣化合物從嗅探口感受到流出物開始和結束的時間，并記錄香氣特征和強度，強度用“1～11”進行打分。

定性分析：香氣物質的定性通過將該組分的保留指數與香氣標準品的保留指數、香氣描述、NIST 20標準譜庫相匹配確定。

MF計算：強度法與檢測頻率法結合，每個樣品在每個色譜條件下被4 名評價員重復嗅聞2 次，依據每個化合物被評價的香氣強度和頻率計算MF[15-16]。按下式計算：

式中：F為某一化合物被嗅聞到的總頻數/嗅聞總次數，取值為百分數；I為小組成員對某一化合物評價的香氣強度之和/（最高分值×嗅聞次數），取值為百分數。

1.3.3 GC-Quadrupole-MS方法對山楂酒香氣物質的定性定量分析

HS-SPME：SPME萃取頭采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS，CTC CombiPAL autosampler多功能自動進樣器實現自動化頂空固相微萃取。樣品瓶在40 ℃以 500 r/min加熱30 min。將已活化的萃取頭插入到樣品瓶頂空中，40 ℃吸附揮發物質30 min。再將萃取頭插入GC進樣口中，熱解吸8 min，進樣口溫度250 ℃。

GC-MS條件：采用7890-5975 GC-MS聯用儀，HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（＞99.999%）；流速1.0 mL/min；不分流模式；升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min；接口溫度280℃；離子源溫度230℃，電子電離源；電離能量70 eV；質量掃描范圍30～350 u。

定性定量分析：通過自動化質譜圖解卷積和鑒定軟件（AMDIS）計算得到保留指數和質譜信息，將質譜分析結果結合NIST 20標準譜庫匹配檢索。在相同色譜條件下，通過C7～C40正構烷烴混合物獲得保留指數。通過內標標準曲線法進行定量分析，有標準品的化合物分別建立標準曲線進行定量，對于沒有標準品的化合物，通過其結構類似物進行半定量[17]。

1.3.4 GC-Orbitrap-MS方法對山楂酒香氣物質的定性定量分析

HS-SPME條件：采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，采用TriPlus RSH自動進樣器。樣品在60 ℃加熱和攪拌平衡30 min后，60 ℃萃取30 min。將萃取頭插入到GC進樣口，熱解吸8 min，進樣口溫度250 ℃。

GC-Orbitrap-MS[10]：采用Trace 1300氣相色譜儀與Q-exact Orbitrap質譜儀聯用分析。DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（＞99.999%）；流速1.0 mL/min；不分流模式；升溫程序：在40 ℃保持5 min，以3 ℃/min升溫至180 ℃，再以3 ℃/min 升溫至250 ℃，保持10 min；總運行時間64 min。電離能70 eV；質量掃描范圍33～300 u。

定性定量分析：在相同色譜條件下，通過C7～C40正構烷烴混合物獲得保留指數。通過匹配香氣物質中的保留時間和離子碎片，與本研究小組建立的香氣化合物檢索數據庫[18]（Food Flavor Laboratory,http://foodflavorlab.cn/）對比進行定性。使用TraceFinder軟件（Thermo Fisher Scientific,Les Ulis,France）進行解卷積，采用Xcalibur 4.1版（Thermo Fisher Scientific,Les Ulis,France）進行化合物定量分析。

1.3.5 OAV計算

化合物含量與閾值的比值即為OAV。本研究認為OAV大于0.1的酯類化合物和OAV大于1的其他類化合物對山楂酒整體香氣具有一定貢獻[13]。

1.4 數據處理

采用https://hiplot-academic.com/basic網站繪制Venn圖，其余實驗數據分析及圖表繪制均使用Microsoft Office Excel 2019軟件。

2 結果與分析

2.1 感官分析結果

對于2 款山楂酒樣品進行定量描述性分析，根 據圖1可以看出發酵型山楂酒SBL-J和配制型山楂酒FS在山楂香和酒精味兩個屬性具有相似的強度。相比而言，SBL-J樣品具有更強的果香，同時具有一些獨特啤酒的香氣；而FS樣品具有較強的甜香和蜂蜜味，同時具有一些獨特的花香、甘草、煙熏和中藥味，增加了酒體香氣的復雜度。

圖1 山楂酒香氣雷達圖Fig.1 Radar chart of hawthorn wine aroma

2.2 GC-O-MS結果

經過GC-O-MS分析，共鑒定到89 種化合物，包括酯類36 種、醇類15 種、萜烯類2 種、酸類12 種、醛類3 種、酮類5 種、苯環類2 種、呋喃類4 種、揮發性酚類3 種、吡喃酮類2 種、硫化物1 種、內酯類化合物4 種（表1和圖2）。酯類化合物在兩款樣品中均為鑒定到數量最多的物質，可以賦予果酒濃郁的果香[19]；其次是醇類和酸類，而苯環類物質和吡喃酮類物質僅在SBL-J中被鑒定到。

表1 利用LLE-SAFE-GC-O鑒定山楂酒中香氣活性化合物Table 1 Odor-active compounds identified in hawthorn wine by LLE-SAFE-GC-O

圖2 利用LLE-SAFE-GC-O鑒定山楂酒中各類香氣物質種類數量Fig.2 Number of aroma compounds identified in hawthorn wine by LLE-SAFE-GC-O

根據表1和圖3，SBL-J樣品共鑒定到65 種香氣物質，在HP-5MS和HP-INNOWAX色譜柱中分別鑒定到了31 種和48 種，兩種色譜柱鑒定出的物質中有14 種保持一致；FS樣品共鑒定到58 種香氣物質，在HP-5MS和 HP-INNOWAX色譜柱中分別鑒定到了28 種和42 種，兩種色譜柱鑒定出的物質中有12 種保持一致。根據表1，使用HP-INNOWAX色譜柱和HP-5MS色譜柱在2 種山楂酒樣品鑒定到的化合物有所區別，相比而言，HP-INNOWAX色譜柱在2 種山楂酒中均鑒定出更多的酯類、醇類、酸類、酮類化合物，因此認為，HP-INNOWAX色譜柱對山楂酒樣品揮發性物質的檢測效果比HP-5MS色譜柱效果更佳，可以檢測到更多的物質。

圖3 不同色譜柱鑒定到的化合物Venn圖Fig.3 Venn diagram of compounds identified using different chromatographic columns

SBL-J中有29 種香氣化合物的MF值大于20%，由HP-5MS和HP-INNOWAX色譜柱各鑒定出12 種和24 種；其中苯乙醇具有最大的MF值（87.26%），被描述為花香、甜香味；其次是乙酸異戊酯（74.62%），被描述為香蕉、果香味。FS中有38 種香氣化合物的MF值大于20%，由HP-5MS和HP-INNOWAX色譜柱分別分離出17 種和27 種；其中MF值最高的是蘋果酸二乙酯（68.36%），被描述為甜香、山楂和綠色；其次是順式-3-己烯-1-醇（66.89%）和2,4-己二烯酸（66.89%），分別被描述為甜香、青草味及山楂、花香味。在SBL-J樣品中有更多的物質被嗅聞并描述為果香，包括一些酯類如異丁酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯，這些酯類僅出現在SBL-J樣品中，同時具有較高的MF值，對樣品的整體香氣有一定貢獻，是感官分析結果中SBL-J樣品具有更強果香的原因之一。FS樣品中被嗅聞到的中藥味可能與MF值較高的(E,E)-2,4-己二烯酸乙酯和4-乙基苯酚有關，這兩種物質都被描述為中藥味，并且在FS樣品中的MF值高于SBL-J樣品。

有16 種化合物在2 種樣品中的MF值均大于20%，包含酯類6 種、醇類5 種、酸類2 種以及呋喃類、硫化物類、內酯類各1 種，且大部分被描述為果香、甜香、蜂蜜。2-甲基丁酸乙酯（果香、奶油、甜香味）、苯乙醇（花香、甜香味）、3-甲硫基丙醇（粗糧、蒸煮、植物味）、5-甲基-3-亞甲二氫-2(3H)-呋喃酮（花香、果香、奶油味）、乙酸（醋味）、異戊醇（油脂、果香、溶劑味）、γ-羧乙氧基-γ-丁內酯（蜂蜜、甜香、果香味）、丁二酸二乙酯（臭味、芝士味）等化合物的MF值較高，對于山楂酒香氣有重要貢獻。化合物呈香可能受濃度的影響[20]，如乙酸乙酯在一定濃度下表現為果香味，濃度過高時則為指甲油味。丁二酸二乙酯在GC-O過程中被嗅聞到臭味和芝士味，而非相關文獻中報告的果香和奶油味[21-22]，可能是由于在樣品中濃度過高產生令人不愉悅的異味。

2.3 香氣物質的定性定量分析

使用GC-Orbitrap-MS和GC-Quadrupole-MS兩種方法對山楂酒進行鑒定，共鑒定到123 種揮發性化合物（表2、圖4）；其中107 種在樣品間存在顯著性差異，推測是不同原料及加工工藝導致[23]。如圖4所示，2 種樣品中醇類、酸類、酯類的含量明顯高于其他類別的組分，其中SBL-J中各類揮發性化合物含量為：醇類＞酯類＞酸類＞其他類化合物；FS中各類揮發性化合物含量為：酯類＞酸類＞醇類＞其他類化合物。SBL-J中香氣物質含量最高的是異戊醇（150.04 mg/L），其次為苯乙醇（48.83 mg/L）。此外，乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、2,4-己二烯酸、2,3-丁二醇、異丁醇、乙酸、乳酸乙酯的含量均超過了3 mg/L。FS中含量最高的物質為2,4-己二烯酸（64.16 mg/L）和乙酸乙酯（40.55 mg/L），異戊醇、乳酸乙酯、乙酸、丁二酸二乙酯、2,3-丁二醇、苯乙醇的含量也超過了3 mg/L。這與前人研究結果較為一致，張峻松等[24]發現山楂酒主要成分為異戊醇（6.09%）、丁二酸二乙酯（3.26%）；高哲等[7]發現丁二酸乙酯、苯乙醇、丁二酸二乙酯、2,3-丁二醇、乳酸乙酯等化合物為山楂酒主要香氣化合物。雖然異戊醇、2,4-己二烯酸、異丁醇等化合物含量較高，但由于其較高的閾值導致OAV均小 于1，對于樣品整體香氣的貢獻較小。

表2 山楂酒中香氣物質含量 Table 2 Contents of aroma compounds in hawthorn wine

圖4 山楂酒中不同種類揮發性成分相對含量比較Fig.4 Comparison of composition of volatile compounds in two hawthorn wines

2.4 OAV分析及關鍵香氣化合物

表3表明，SBL-J和FS中各有29 種和33 種香氣化合物的OAV大于1（酯類OAV大于0.1），其中有27 種物質同時存在于2 種樣品中。SBL-J中OAV最高的化合物為苯乙醇（86.54），其次為丙酸乙酯（80.10）和乙酸異戊酯（43.65）；FS中OAV最高的物質為α-松油醇（70.68），其次為丙酸乙酯（56.80）和苯乙醛（46.44）。雖然丙酸乙酯在2 種樣品中的含量均較低（11.36～16.02 μg/L），但由于其閾值較低（0.2 μg/L），仍具有較高的OAV，對樣品整體香氣有重要貢獻。苯乙醇在SBL-J中的OAV高于FS，主要是由于苯乙醇屬于發酵類香氣物質，有研究[54]表明，大部分的醇通過酵母Ehrlich途徑產生。SBL-J中乙酸異戊酯的OAV更高，同樣是由于乙酸異戊酯主要來源于發酵過程[54]。

表3 山楂酒關鍵香氣化合物的OAVTable 3 OAVs of the key aroma compounds in hawthorn wine

大多OAV較高的揮發性化合物，其MF值同樣也較高，兩者保持較好的一致性。例如，OAV較高的異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、苯乙醇、正辛酸、苯乙醛、丁香酚等，MF值均在20%以上。SBL-J和FS中各有7 種和9 種香氣物質的MF值大于20%且OAV大于1（酯類大于0.1）：SBL-J中為2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯；而FS中為 2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、蘋果酸二乙酯、苯乙醇、(E,E)-2,4-己二烯酸乙酯、正辛酸、苯乙醛、丁香酚。這些香氣物質是山楂酒樣品重要的特征風味物質。對比2 種樣品存在差異的特征風味物質能夠發現，發酵型山楂酒SBL-J的特征風味物質除貢獻花香和甜香的苯乙醇外，其余均是貢獻果香的酯類化合物，與感官分析結果中SBL-J樣品較高的果香得分相對應；配制型山楂酒FS的特征風味物質中(E,E)-2,4-己二烯酸乙酯貢獻的中藥味以及丁香酚貢獻的醬香、香料味是2 種樣品感官分析過程中中藥味、醬香味產生區別的重要原因。

3 結論

采用定量描述性分析對發酵型和配制型山楂酒進行感官分析，并采用LLE-SAFE方法對發酵型和配制型山楂酒中揮發性組分富集提取，通過GC-O-MS在兩樣品中分別鑒定到65 種和58 種。發酵型山楂酒SBL-J中MF值較大的化合物包括苯乙醇、乙酸異戊酯；配制型山楂酒FS中包括蘋果酸二乙酯、順式-3-己烯-1-醇、2,4-己二烯酸等。通過GC-Orbitrap-MS和GC-Quadrupole-MS兩種方法進行香氣組分的定性和定量，共鑒定到123 種揮發性化合物。結合MF值與OAV分析發現SBL-J和FS中各有7 種和9 種香氣成分的MF值大于20%且OAV大于1（酯類大于0.1），這些香氣成分是山楂酒的重要呈香物質。本研究結果有助于山楂酒香氣深入解析和定向調控等工作 的開展。