落新婦苷的穩定性及生物活性研究進展

陳荷瑩 劉 毅 劉會珍 陳佳倩 金 晨 黃慧蓮

(江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室,南昌,330004)

落新婦苷具有“藥食同源”性,存在于很多自然界植物和食物中,如黃杞[1]、土茯苓[2]、龜苓膏[3]、葡萄酒[4]等,具有選擇性免疫抑制、抗氧化、抗腫瘤、保肝等多種生物活性。近年來,國內外科研人員對其進行了廣泛研究,本文將從落新婦苷的化學結構、穩定性、純化技術、藥代動力學、生物活性等方面進行綜述,為深入研究提供依據。

1 化學結構及其立體異構體

落新婦苷,即(2R,3R)-花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷,是1950年由Kozo Hayashi等首次從植物落新婦中提取得到的化合物[5]。它也是土茯苓中主要有效成分,被2020年版《中華人民共和國藥典》列為含量測定指標。由于C-2、C-3的位置構型不同,它有4個立體異構體,分別是落新婦苷(2R,3R)、新落新婦苷(2S,3S)、新異落新婦苷(2S,3R)和異落新婦苷(2R,3S)。這4個立體異構體通常都同時存在植物中,能夠通過中間體查爾酮相互轉化,其中落新婦苷是主要成分[6-7]。

2 穩定性研究

黃酮類化合物通常有水溶性差、不穩定等特點。MAINI等[8]使用高效液相色譜法和紫外檢測比較了高良姜素、山柰酚、槲皮素和楊梅素4種黃酮類化合物在培養基中通過紫外輻射后穩定性的大小,結果表明黃酮醇的穩定性會隨著B環上取代基數目的增加而降低。ZHANG等[9]、付瑩娟[10]也證實了這一結論:4′-羥基取代的B環的落新婦苷比3′,4′-二羥基取代的B環更穩定。落新婦苷及其立體異構體都不太穩定,容易受到外界溫度、pH、金屬離子等因素的影響。pH和溫度能影響落新婦苷的異構化和降解反應,pH值和溫度越高,異構化和降解速度越快。落新婦苷在pH值為4～5、溫度為50 ℃以下的環境中比較穩定,在中性、弱堿性溶液中以異構化為主,分解速度較慢,當pH>10時,落新婦苷的分解速度變快[10-12]。當溫度為25～40 ℃時,落新婦苷異構化成新異落新婦苷,異落新婦苷異構化成新落新婦苷;在60～80 ℃時,落新婦苷和新異落新婦苷都異構化為新落新婦苷[13]。

落新婦苷的穩定性會因其所溶解的溶劑不同而有差異,依次為50%乙醇>乙醇>甲醇>50%甲醇>水。它在不同的培養基中穩定性也不一樣,依次為水>RPMI1640>高糖DMEM>低糖DMEM[10]。常見食品添加劑及金屬離子也能影響落新婦苷穩定性:維生素C抗壞血酸和蔗糖可以抑制落新婦苷的分解,但是會促進其異構化;抗壞血酸對落新婦苷具有保護作用,但是也會加速其異構化;常用防腐劑苯甲酸鈉無明顯影響;Mg2+、Ca2+、Na+、K+等金屬離子對落新婦苷有一定的增穩作用;Al3+可以完全抑制落新婦苷異構化,而對其分解沒有任何影響;Cu2+、Zn2+、Fe3+能夠加快落新婦苷分解,降低其穩定性,其中Fe3+特別明顯[12,14]。

3 落新婦苷的純化技術

高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatography,HSCCC)是一種可行的分離黃酮類化合物的技術。FAN等[15]采用高速逆流色譜法,使用由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶1∶10,v/v/v)組成的兩相溶劑體系,從菝葜提取物中純化落新婦苷、新異落新婦苷,其純度均大于98%。GUO等[16]提出了一種非傳統的高速逆流色譜法,能夠有效地從植物根莖中分離化合物。一種基于擠出模式的離線二維循環型高速逆流色譜(2D R-HSCCC)先將混合物收集于儲存柱中,循環分離最后采集得到純度大于96%的落新婦苷。WU等[17]建立了從土茯苓粗提物中分離和純化的高效離心分配色譜(Centrifugal Partition Chromatograph,CPC)法,以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶1∶10)作為兩相溶劑系統,獲得化合物純度為98.5%。

4 藥代動力學研究

落新婦苷在體內的代謝過程符合二室開放模型[18],具有水溶性差、口服吸收困難、生物利用度低的特點。研究人員給大鼠口服不同濃度的落新婦苷,采用液質色譜-串聯質譜法(Liquid Chromatography-mass Spectroscopy/Mass Spectroscopy,LC-MS/MS)測定大鼠血漿和各種組織樣品中落新婦苷的濃度,藥代動力學結果顯示12 mg/kg、24 mg/kg的落新婦苷給藥大鼠后,化合物生物利用度分別為(1.16±0.695)%和(1.27±0.379)%,血漿半衰期分別為(101±35.8)min和(109±25.3)min[19]。聚維酮和吐溫80結合使用可以顯著改善落新婦苷的吸收能力,提高口服生物利用度[20-21]。用玉米蛋白-酪蛋白酸納米顆粒包封落新婦苷可以提高化合物的口服生物利用度,用納米顆粒制備的落新婦苷能夠提高其穩定性[22]。ZHAO等[23]用超高液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用技術(Ultra Performance Liquid Chromatography-quadrupole/Time Of Flight-mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)1中文錯誤,2給出英文和英文縮寫分析落新婦苷在人體腸道細菌中的代謝物,檢測到細菌樣品中有槲皮素和圣草酚2種生物活性代謝物。

5 藥理學與毒理學研究

5.1 選擇性免疫抑制作用 正常的免疫反應是機體維持自我平衡和抵御外來入侵的主要機制,而過度的免疫反應則會引起各種自身免疫性疾病、過敏反應和炎癥反應。免疫抑制藥物通過抑制免疫反應來治療相關疾病。然而免疫抑制治療大都受限于缺乏抗原特異性,這通常導致整個免疫系統功能的普遍抑制和各種不良反應的發生[24-26]。落新婦苷具有獨特的免疫抑制模式,可以選擇性地消除參與某些特定疾病的淋巴細胞群而不降低機體的整體免疫活性,不同于環孢菌素A和其他免疫抑制劑。

落新婦苷能選擇性抑制遲發型超敏反應的效應期而非誘導期,通過下調基質金屬蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase2,MMP2)和MMP-9的活性選擇性抑制淋巴細胞功能,包括細胞遷移,從而抑制遲發型超敏反應相關的炎癥[27]。它還能影響Th1/Th2細胞間的動態平衡,選擇性地抑制活化的Th1細胞,而不影響Th2細胞。細胞因子的負調控也是選擇性免疫抑制的重要機制。落新婦苷一方面通過抑制Th1細胞因子產生,上調白細胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的下游蛋白、細胞因子信號傳送阻抑物1(Suppressor of Cytokine Signaling,SOCS)1和SOCS3;另一方面減少腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和γ-干擾素,在體內實現其接觸性超敏反應的免疫調節功能[27-28]。與常用的免疫抑制劑環孢菌素A相比,落新婦苷能選擇性抑制活化的T淋巴細胞,而對正常T淋巴細胞和其他免疫細胞無影響,不良反應較弱,更有益于治療慢性免疫疾病。

此外,落新婦苷對樹突狀細胞(Dendritic Cell,DC)也有選擇作用。它通過抑制DC的成熟和抗原呈遞功能,阻止T細胞活化,從而抑制心臟同種異體移植物排斥反應。當落新婦苷與環孢菌素A共同給藥時,顯著延長了移植物的存活率,且呈劑量依賴性[29]。DING等[30]報道了落新婦苷能誘導結腸炎小鼠DC中轉化生長因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)和IL-10的產生,在DC中內源性TGF-β的產生促進了CD4+、CD25+、叉頭框蛋白P(Forkhead Box P,Foxp)3+調節性T細胞的誘導以及CD103+的表達,同時它還抑制DC分泌IL-1β、IL-12 p40和CD86+。因此,落新婦苷可以作為候選藥物通過誘導DC介導其調節功能來治療炎癥性腸病和其他炎癥性疾病,如多發性硬化、牛皮癬和類風濕性關節炎等[31]。

5.2 抗氧化作用 類黃酮是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的重要化合物。它們具有在體內螯合過渡金屬離子、清除自由基和誘導抗氧化酶的能力。因此,大多數類黃酮化合物都是有效的天然抗氧化劑。落新婦苷能有效清除2,2-二苯基-1-吡啶并肼基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical,DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]和超氧陰離子的自由基,抑制亞油酸過氧化。其效果與合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(Butyl hydroxyanisole,BHA)和2,6-二叔丁基對甲酚(Butylated hydroxytoluene,BHT)相當[32]。落新婦苷能抑制超氧陰離子的生成,抑制細胞色素P450還原酶誘導的微粒體脂質過氧化,保護紅細胞免受氧化溶血[33]。PETACCI等[34]報道落新婦苷以濃度依賴性關系抑制髓過氧化物酶和辣根過氧化物酶活性,并有效清除次氯酸。類黃酮環中的取代模式可以增加或降低抗氧化活性,落新婦苷B環中的3′,4′-鄰二羥基構型和C環中的4-羰基具有自由基清除活性。ZHANG等[35]利用落新婦苷的抗氧化作用來研究其對鎘毒性的拮抗作用,結果表明它可以通過氧化應激緩解鎘誘導的鯉魚頭腎淋巴細胞的凋亡。

5.3 抗炎作用 炎癥反應是機體一種重要的免疫防御機制。巨噬細胞是一種重要的免疫細胞,可參與調節炎癥反應過程。脂多糖通過細胞信號轉導系統激活巨噬細胞進入炎癥狀態,增加炎癥介質mRNA的表達,從而導致多種炎癥介質的產生。HUANG等[36]研究發現落新婦苷對脂多糖刺激的小鼠巨噬細胞中Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLR)、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、單核細胞趨化蛋白1和環氧化酶-2具有抑制作用。它還可以顯著抑制一氧化氮和TNF-α的產生,以及誘導型一氧化氮合酶和TNF-α的mRNA表達,這些作用可能與p65、細胞外信號調節激酶1/2和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal Kinase)通路有關[37]。落新婦苷能抑制急性肺損傷大鼠的支氣管肺泡中炎癥介質、趨化因子的產生及巨噬細胞抑制因子的表達,從而抑制炎癥反應[38-39]。此外,落新婦苷還可以抑制膠原蛋白-Ⅰ和膠原蛋白-Ⅲ的表達,降低了炎癥介質TNF-α、IL-1β、IL-6的表達,有效改善四氯化碳誘導的肝損傷[40]。

Th17細胞在銀屑病的發病機制中發揮重要作用[41-42]。銀屑病俗稱牛皮癬,是免疫介導的炎癥性皮膚病,其發病與炎癥細胞浸潤和炎癥介質有關[43]。落新婦苷可以通過抑制Th17相關的炎癥反應來減輕牛皮癬樣皮膚損傷。落新婦苷可以改善咪喹莫特誘導的角質形成細胞增殖,減少CD3+細胞向牛皮癬病變組織的浸潤,并改善循環CD4+和CD8+T細胞和炎癥介質(IL-17A,TNF-α,IL-6,IFN-γ和IL-2)的升高。在體外,落新婦苷抑制Th17細胞分化、IL-17分泌和Jak/Stat3信號轉導,同時上調牛皮癬病變中信號轉導及轉錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription,STAT)3抑制劑SCOSE3的表達[44-45]。

在類風濕關節炎小鼠模型中,落新婦苷和低劑量氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)的聯合使用,會顯著抑制血清中的抗體(IgG,IgG1,IgG2a,IgM和抗膠原IgG)和炎癥介質(IL-1β,IL-6,TNF-α,IFN-γ和IL-17A)的表達[46]。宋偉等[47]為了探討落新婦苷抗骨關節炎作用機制,運用網絡藥理學預測落新婦苷可能直接作用于STAT1、STAT3、RAS等靶點,通過影響AGE/RAGE信號通路,抑制TNF-α表達促進CCND1的表達,進而促進軟骨細胞的增殖和抑制炎癥介質的產生。李中華等[48]也通過實驗證實落新婦苷可以有效緩解骨關節炎癥狀,其原因可能與抗炎和軟骨機制降解有關。

NAKAHARA等[49]證實落新婦苷不僅可以增加Caco-2細胞的跨上皮電阻值、密封蛋白-1和緊密連接蛋白-2的mRNA表達水平以及密封蛋白-1和緊密連接蛋白-2的蛋白質表達水平,而且還上調了與TNF-α加γ干擾素共同處理的Caco-2細胞中緊密連接蛋白的表達。其結果表明落新婦苷可以增強緊密連接蛋白的表達,導致腸細胞中屏障功能的上調,有效改善結腸炎。RAO等[50]研究發現落新婦苷作為膳食補充劑能夠抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠模仿外周感染的神經炎癥。落新婦苷能有效減少LPS誘導小鼠的炎癥標志物,同時抑制TLR-4和腦源性神經營養因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)表達,在預防老年人群急性精神障礙方面擁有巨大的發展潛力。

5.4 降血糖、血脂作用 晚期糖基化終末產物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是過量的糖和蛋白質結合的產物,能夠加速人體的衰老,引起各種慢性退化性疾病,比如糖尿病。落新婦苷能抑制AGEs的形成,其作用與槲皮素相同[51]。NGUYEN等[52]發現土茯苓乙酸乙酯提取物對體內2型糖尿病模型的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶表現出較強的抑制活性,可顯著降低糖尿病小鼠的血糖,并對肝臟無損害作用。糖尿病腎病是糖尿病患者最重要的并發癥之一。落新婦苷可以抑制高糖刺激的HK-2細胞產生TNF-β1和結締組織生長因子,以及通過PI3K/AKT通路減弱高濃度葡萄糖誘導的HK-2細胞自噬和凋亡來改善糖尿病腎病臨床病癥[53]。

落新婦苷可以通過激活AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)來抑制脂質積累。激活的AMPK不僅可以通過抑制脂肪酸合成酶的活性來降低脂質的生物合成,而且還可以提高脂肪三酰甘油脂肪酶的表達,增加激素敏感脂肪酶的磷酸化,從而促進脂解[54]。落新婦苷還能夠降低黏菌與擬桿菌的比例,通過增加有益細菌并減少有害細菌來改善高脂肪飲食小鼠誘導的腸道微生物生態失調,從而增強腸道碳水化合物和脂質代謝[55]。趙磊等[56]也證實了土茯苓中的類黃酮提取物能夠緩解肝細胞的變性程度,調節腸道中短鏈脂肪酸的含量,逆轉高脂肪飲食誘導的大鼠的腸道生態失調。

5.5 抗腫瘤作用 WANG等[57]利用落新婦苷在人前列腺癌細胞中測試發現,落新婦苷具有潛在的抗增殖作用。其抗增殖的作用機制可能是對幾種信號通路的影響的組合,包括炎癥性核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信號通路和一些增殖通路。落新婦苷對乳腺癌細胞也表現出抗增殖作用和促凋亡作用[58]。SA等[59]發現落新婦苷能夠通過激活線粒體和半胱天冬酶來誘導肝癌細胞系HepG2和Hep3B細胞凋亡,對肝癌的發生具有潛在的保護作用。

5.6 抗血管疾病作用 研究發現,巴西特有物種古柯屬植物的提取物落新婦苷會顯著抑制血管緊張素轉化酶,其活性與卡托普利沒有差異,具有潛在的抗高血壓作用[60]。落新婦苷可以改善糖尿病大鼠免受心肌缺血再灌注損傷,減少梗死面積,改善血流動力學,減輕心肌損傷,這些作用與糖尿病大鼠缺血心肌組織中炎癥介質血清水平、高遷移率族蛋白B1、磷酸化核因子κB的降低相關。落新婦苷還可以直接刺激心臟血流動力學并抑制心肌細胞壞死[61]。ZHAO等[62]報道了落新婦苷通過抑制平滑肌增殖,可以有效地防止同種異體移植中動脈硬化的發生。另有研究報道落新婦苷的一些衍生物具有顯著的抗傷害性和抗生血管性質,但如果其衍生物連有糖、羥基和乙酰基等極性基團存在時則會降低鎮痛活性[63]。

5.7 落新婦苷的細胞毒性檢驗 GAO等[64]研究發現口服不同劑量落新婦苷的大鼠與對照組的毒性差異無統計學意義,未觀察到不良反應,各項指標參數正常,用Ames試驗、染色體畸變試驗和哺乳動物微核試驗評估了落新婦苷的遺傳毒性,其結果顯示測試菌株都沒有遺傳毒性。該項研究結果表明,落新婦苷可以安全應用,為開發天然藥物、功能性食品或食品添加劑提供了可能,為未來的臨床研究提供了重要保障。

6 總結

落新婦苷是二氫黃酮醇苷類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病等多種生物活性,具有廣泛的臨床應用前景。本文全面系統地總結了落新婦苷的活性成分研究并且首次對影響落新婦苷穩定性因素進行歸納概括,為日后新藥研發提供更多的參考依據。近年來,落新婦苷具有選擇性免疫抑制作用并且無口服毒性和遺傳毒性,這一天然優勢引起了科研人員的高度關注,可能有望研發出新的免疫抑制藥物。

目前,有關落新婦苷的研究多集中于細胞實驗或動物實驗,臨床研究薄弱,再加上落新婦苷具有水溶性差、生物利用度低的特點,尚未開發出相關藥物,使其不能很好發揮藥用價值。開發納米新劑型或選擇其他合適溶劑溶解或許是臨床研究的新方向。

利益沖突聲明:無。