響應面法優化破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取工藝

＊武悅 李若綺 徐勤科 郭朝暉 孫鶯*

（1.甘肅省藥品檢驗研究院 甘肅 730070 2.國家藥監局中藥材及飲片質量控制研究重點實驗室 甘肅 730000）

靈芝孢子粉具有增強機體免疫力、降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎癥、抑制腫瘤、調節胃腸道菌群、緩解體力疲勞、保肝護肝、改善睡眠[1-5]等藥理作用，近幾年還有報道證實靈芝孢子粉對阿爾茲海默癥有一定預防作用[6]。近年來，學者發現靈芝孢子粉中脂溶性物質含量較高，可達30%左右[7]，且這些脂溶性物質具有一定的生物活性，其中甘油三酯類被認為具有有效的抗腫瘤作用[8]，因此建立甘油三酯類物質含量的測定方法于破壁靈芝孢子粉質量標準的制定非常重要。本試驗采用超聲波法提取甘油酸油酸酯，建立了高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法測定破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的含量，為破壁靈芝孢子粉質量標準的制定提供參考依據。

1.材料與方法

(1)材料與試劑

破壁靈芝孢子粉樣品由青海及祥藥業有限公司提供；甘油三油酸酯對照品由中國食品藥品檢定研究院提供（供含量測定用，含量為：99.6%，批號：111692-202007）；二氯甲烷（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）德國默克公司。

(2)儀器與設備

Agilent 1260系列液相色譜儀，美國安捷倫公司；Alltech ELSD-6000型蒸發光散射檢測器，美國Alltech科技有限公司；梅特勒XS205DU電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SBL-30DT(N)型超聲波恒溫清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

(3)儀器工作條件

①色譜條件

色譜柱：SHISEIDO CAPCELLPAK C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；流動相:二氯甲烷:乙腈=68:32；漂移管溫度：61℃；氮氣流速：1.7L/min。

②對照品溶液的制備

精密稱取甘油三油酸酯對照品適量，加流動相制成每1mL含0.7mg的溶液，即得。

(4)破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取

精密稱取破壁靈芝孢子粉0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相25mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用流動相補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

(5)不同提取條件對破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取效果的影響

采用單因素試驗考察料液比、超聲功率、超聲時間和超聲溫度對破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取率的影響，再采用響應面法優化提取參數。

2.結果與分析

(1)單因素試驗結果

①料液比對甘油三油酸酯提取率的影響

由圖1可知，隨著提取溶劑的增多，甘油三油酸酯的提取效果隨之提高。當料液比為0.1:10時，測定甘油三油酸酯的含量僅為3.64%；當料液比為0.1:25時，測得甘油三油酸酯的含量顯著升高，達4.92%；料液比為0.1:30時，測得甘油三油酸酯的含量稍有降低，為4.80%，但與料液比為0.1:25時測得甘油三油酸酯的含量差異不顯著。

圖1 料液比對甘油三油酸酯含量的影響

②超聲功率對甘油三油酸酯提取率的影響

由圖2可以看出，隨著超聲功率的增大，測得甘油三油酸酯的含量先升高后降低。當超聲功率為560W時，測得甘油三油酸酯的含量達4.92%；超聲功率為640W時，甘油三油酸酯提取率顯著下降至4.72%。

圖2 超聲功率對甘油三油酸酯含量的影響

③超聲時間對甘油三油酸酯提取率的影響

由圖3可以看出，隨著超聲提取時間的延長，測得甘油三油酸酯的含量先升高后降低。當提取時間為30min時，甘油三油酸酯的含量達到峰值，為4.92%；超聲時間為40min時，甘油三油酸酯提取率稍有下降，為4.87%，但與超聲30min時的提取率之間差異不顯著。

圖3 超聲提取時間對甘油三油酸酯含量的影響

④超聲溫度對甘油三油酸酯提取率的影響

由圖4可以看出，隨著超聲溫度的升高，測得甘油三油酸酯的含量先平緩升高后顯著降低。當超聲溫度為60℃時，甘油三油酸酯的含量達4.93%；超聲溫度為80℃時，甘油三油酸酯提取率顯著下降至3.62%。

圖4 超聲提取溫度對甘油三油酸酯含量的影響

(2)響應面優化試驗結果

根據單因素試驗結果，得到破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取的最佳條件為：料液比為0.1:25（g·mL-1），超聲功率為560W，超聲時間為30min，超聲溫度為60℃。在單因素試驗的基礎上，選取料液比、超聲功率和超聲時間三個因素進行三因素三水平的Box-Benhnken試驗，進一步優化并篩選最佳的溶解條件（表1～表2）。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平表

表2 響應面試驗的Box-Behnken設計及結果

對表3中得到的提取率進行回歸分析，得到如下回歸方程：

表3 回歸模型及因素的方差分析

經方差分析可知（表3），該模型方程極顯著。在本試驗設定范圍內，因素A、C、A2、B2、C2、AB、AC對甘油三油酸酯提取率影響極顯著。模型的失擬項不顯著，說明回歸方程較好的擬合了試驗數據，試驗誤差小。

(3)驗證試驗

利用Design Expert軟件獲得最佳提取條件：料液比為0.1:22.01，超聲功率為550.93W，超聲時間為31.19min，破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取率為5.08%。在各因素最佳條件下對響應面分析結果進行驗證，考慮實際操作性，將最優提取條件修正為料液比0.1:25（g·mL-1），超聲功率為560W，超聲時間為30min。在此基礎上試驗進行五次，最終得到甘油三油酸酯平均提取率為5.01%，與預測值5.08%相近，相對誤差為1.4%，表明模型可靠，可以用于破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取。

3.結論

采用響應面法優化破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取方法。利用響應面建立甘油三油酸酯提取率的二次多項式數學模型，并對三因素的響應值影響進行顯著性分析，結果表明，所建模型擬合度高，實驗誤差小，最終確定提取條件為料液比0.1:25（g·mL-1），超聲功率560W，超聲時間30min。在此條件下，破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取率為5.01%，與預測值接近，模型可靠。