基于TLR4/MAPK信號通路探討柚皮素對類風濕關節炎大鼠的治療作用

黃浦洋 江強 黃巧霞 符圣亮 王聰

(儋州市人民醫院腎病風濕科,海南 儋州 571700)

類風濕關節炎(RA)是一種炎癥性疾病,其特征是炎癥細胞滲透到滑液中,導致滑膜、關節軟骨和關節骨骼變性〔1,2〕。由于久坐的生活方式和對RA的認識不足,中國RA(尤其是女性)的患病率正在增加〔3〕。Toll樣受體(TLR)4是一種非特異性免疫的蛋白質分子,其可調控下游因子絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)參與病理生理過程中的炎癥反應。Huang等〔4〕研究顯示,抑制TLR4/MAPK信號通路表達可減輕急性肺損傷小鼠肺組織的炎癥反應。Wu等〔5〕研究報道,TLR4/MAPK通路下調可減輕四氯化碳誘導的小鼠肝臟炎癥反應,減少病原菌。柚皮素是一種二氫黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用〔6〕。有研究報道,柚皮素可減輕丙烯酰胺腎毒性大鼠腎組織氧化應激和炎癥反應,改善腎組織細胞凋亡,從而保護大鼠腎功能〔7〕。Wang等〔8〕研究表明,柚皮素可改善單側輸尿管梗阻大鼠腎組織病理結構,降低炎癥因子表達,從而發揮抗腎間質纖維化的作用。但柚皮素是否對RA有治療作用尚未有研究。故本研究擬通過TLR4/MAPK信號通路探究柚皮素對RA大鼠的作用效果,以期為RA的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1動物 雄性SD大鼠(清潔級,10周齡,體質量247～270 g),購自昆明醫科大學實驗動物中心,生產許可證號:SCXK(云)2021-0002。在自然通風、12 h明暗循環、(26±2)℃環境中飼養1 w。本研究經儋州市人民醫院倫理委員會批準。

1.2主要藥物、試劑和儀器 柚皮素(批號480-41-1,原料藥,純度99.98%,上海純優生物科技有限公司);甲氨蝶呤片(批號20211209,吉林省通化茂祥制藥有限公司);牛Ⅱ型膠原液體、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)盒、TRIzol試劑、蛋白提取試劑盒、羊抗鼠二抗(批號分別為JK56958S、JK52147S、JK25968S、JK48968S、JK20159S、JK90157、JK20671,北京中生瑞泰科技有限公司);白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色劑、MAPK單克隆抗體(批號分別為M-19152、M-19131、M-50174,北京金道欣生物技術有限公司);IL-1β ELISA試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、TLR4單克隆抗體、β-actin單克隆抗體(批號分別為21-1712、21-19143、21-06072、22-09124,武漢諾見生物技術有限公司);酶標儀、顯微鏡(型號分別為Synergy H4、MWP-101,上海然哲儀器設備有限公司);熒光定量PCR儀(型號Q380,上海實維實驗儀器技術有限公司);化學發光圖像分析儀(型號ChampChemi 610,南京世研儀器設備有限公司)。

1.3動物建模、分組及給藥 根據文獻〔9〕中的方法進行RA大鼠造模:將濃度為2 mg/ml的牛Ⅱ型膠原液體與完全弗氏佐劑按等比例混合成混懸液A,與不完全弗氏佐劑按等比例混合成混懸液B。采用乙醚麻醉大鼠后,第1天從尾根部注射混懸液A 0.1 ml,第7天從尾根部注射混懸液B 0.1 ml,第14天觀察到大鼠踝關節明顯紅腫且體積增大,則表明造模成功〔9〕。成功造模56只大鼠,隨機分成模型組、甲氨蝶呤組(1 mg/kg)〔10〕、柚皮素低劑量組(50 mg/kg)、柚皮素高劑量組(100 mg/kg)〔11〕,每組14只。另取14只健康大鼠分別于第1天和第7天尾根部各注射0.1 ml生理鹽水設為對照組。造模成功后,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組分別灌胃1 mg/kg的甲氨蝶呤、50、100 mg/kg的柚皮素(濃度分別為0.1 mg/ml的甲氨蝶呤混懸液、5、10 mg/ml的柚皮素混懸液,灌胃體積10 ml/kg);模型組和對照組灌胃10 ml/kg的生理鹽水,1次/d,連續給藥4 w。

1.4關節腫脹度檢測 分別于造模前、給藥結束后第1天,采用足趾容積測量儀測量大鼠左側后足爪體積,方法如下:以大鼠左側后足踝關節上0.8 cm為基準,將0.8 cm以下的部位全部浸沒在水槽中,讀取大鼠左側后足體積(取測量5次的平均值),計算關節腫脹度〔關節腫脹度=(給藥結束后第1天體積值-造模前體積值)/造模前體積值×100%〕。

1.5關節腫脹評分 分別于造模成功后第1天、給藥結束后第1天對大鼠雙側后足爪關節腫脹進行評分,標準如下〔12〕:正常無紅腫計0分;趾關節紅腫計1分;足趾和趾關節腫脹計2分;踝關節以下部位腫脹發紅計3分;整只足爪腫脹計4分。統計兩只后足爪腫脹情況,將兩只后足爪評分之和計為總評分,最高為8分,得分越高表示腫脹程度越嚴重。

1.6血清炎性指標檢測 于給藥結束后第1天用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈取血3 ml,分離血清,采用ELISA檢測血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.7踝關節組織病理觀察 斷頭處死大鼠,獲取右側后足踝關節組織,清洗后經乙二胺四乙酸脫鈣,石蠟包埋、切片(4 μm厚),HE染色后顯微鏡觀察病理變化。

1.8踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達檢測 取右側后足踝關節滑膜組織,將其勻漿,利用TRIzol試劑提取滑膜組織中總RNA,逆轉錄合成cDNA,在熒光定量PCR儀上進行反應。PCR條件如下:95 ℃持續48 s,42個循環(95 ℃持續5 s,60 ℃持續34 s,73 ℃持續21 s),引物由北京龍躍生物科技發展有限公司合成。序列如下:TLR4上游引物:5′-CACACCCCAGCCATGTACG-3′,下游5′-ATGTCACGCACGATTTCAC-3′;MAPK上游引物:5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3′,下游:5′-ATCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3′;β-actin上游引物:5′-AAGGAGGTGGCTATGACAGAG-3′,下游:5′-GTGAGTGCGTTAGGCCCAT-3′。以2-ΔΔCt法計算TLR4、MAPK mRNA表達水平。

1.9踝關節滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達檢測 取1.8中勻漿的踝關節滑膜組織,蛋白提取試劑盒提取滑膜組織中的總蛋白,進行蛋白濃度定量后,上樣100 μg總蛋白進行電泳和轉膜操作,12%脫脂奶封閉膜3 h,加入TLR4(1∶700)、MAPK(1∶900)、β-actin(1∶1 100)單克隆抗體,在5 ℃環境下孵育24 h,洗膜后添加羊抗鼠二抗(1∶2 100)于26 ℃孵育4.5 h,增強型化學發光圖像分析儀對蛋白條帶進行可視化,并使用Image-Pro Plus軟件對蛋白表達進行定量。

1.10統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行數據處理,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1柚皮素對關節腫脹度和關節腫脹評分的影響 與對照組比較,模型組關節腫脹度和關節腫脹評分顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組關節腫脹度和關節腫脹評分顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組關節腫脹度和關節腫脹評分顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組關節腫脹度和關節腫脹評分差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組關節腫脹度和關節腫脹評分、血清TNF-α、IL-6、IL-1β比較

2.2柚皮素對血清炎性指標的影響 與對照組比較,模型組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3柚皮素對踝關節組織病理的影響 對照組踝關節表現出正常的關節軟骨結構,沒有中性粒細胞浸潤;模型組踝關節軟骨層明顯增厚,表現出彌漫性中性粒細胞浸潤,關節軟骨侵蝕和滑膜炎(箭頭所示);甲氨蝶呤組及柚皮素高劑量組踝關節結構完整,無中性粒細胞浸潤和炎癥表現;柚皮素低劑量組踝關節具有少量炎癥細胞浸潤(箭頭所示),軟骨結構疏松紊亂。見圖1。

圖1 各組踝關節組織病理結構(HE染色,×200)

2.4柚皮素對踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達的影響 與對照組比較,模型組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達水平顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達水平顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA及蛋白表達水平比較

2.5柚皮素對踝關節滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達影響 與對照組比較,模型組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達水平顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

1～5:對照組、模型組、甲氨蝶呤組、柚皮素低劑量組、柚皮素高劑量組圖2 各組踝關節滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達

3 討 論

RA是一種自身免疫性關節疾病,其特征是滑膜炎癥和增生、關節軟骨退化和結構性骨侵蝕,導致進行性殘疾。有證據表明,RA的發病機制涉及多種免疫、環境和遺傳因素〔13〕。但是該疾病嚴重程度及炎性和破壞性介質表達增加的根本原因仍然未知。RA的當前治療策略包括使用非甾體抗炎藥、改善病情的抗風濕藥及使用皮質類固醇和抑制主要促炎細胞因子合成的生物化合物。這些藥物可長期緩解RA癥狀,但在治療中斷后,仍可導致疾病復發〔14〕。疾病復發是治療RA的潛在障礙之一,為了在RA治療中獲得更多益處,需要開發新藥以獲得長期緩解。

柚皮素具有優秀的抗風濕、抗炎作用。Zhang等〔15〕研究發現,柚皮素可通過減少炎癥細胞浸潤和滑膜損傷,有效改善RA大鼠治療效果。Hua等〔16〕研究表明,柚皮素可改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠代謝參數,抑制肝脂肪變性,減少肝纖維化和細胞衰老,抑制肝臟炎癥。Yang等〔17〕發現,柚皮素可降低多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織炎癥,改善氧化微環境和胰島素抵抗,發揮對多囊卵巢綜合征的治療作用。本研究表明,柚皮素可改善RA大鼠關節腫脹和踝關節病理狀況,抑制炎癥反應,與上述研究結果一致。

TLR4/MAPK信號通路是炎癥和各種免疫疾病發展中的關鍵角色。Li等〔18〕研究發現,抑制TLR4/MAPK信號通路可減輕脂多糖誘導的膿毒癥大鼠炎癥反應,提高大鼠存活率。Hassanein等〔19〕研究表明,反式阿魏酸可抑制TLR4/MAPK炎癥信號通路,減輕順鉑誘導的睪丸損傷大鼠睪丸組織氧化應激過程,增強其體外細胞抗毒活性,對順鉑誘導的睪丸損傷顯示出潛在的保護作用。Li等〔20〕報道,抑制TLR4/MAPK通路可減輕RA大鼠癥狀(如腫脹、發紅和滑膜炎),降低關節炎指數評分,并下調血清IL-6、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和TNF-α等促炎細胞因子水平。本研究表明,柚皮素可抑制RA大鼠踝關節滑膜組織中TLR4/MAPK信號通路表達。研究發現,TLR4信號通路可影響重癥急性胰腺炎患者血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平,TLR4信號通路活性與TNF-α、IL-1β和IL-6呈正相關〔21〕。結合本研究結果,推測柚皮素對RA大鼠的治療作用,可能與其抑制TLR4/MAPK信號通路激活有關。

綜上所述,柚皮素對RA大鼠的治療作用明顯,可改善RA大鼠關節腫脹和踝關節病理狀況,抑制炎癥反應,其機制可能與柚皮素抑制RA大鼠踝關節滑膜組織TLR4、MAPK mRNA和蛋白的表達進而抑制TLR4/MAPK信號通路的激活有關。