加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及ASMCs作用的相關機制

鄭忻 曲妮妮 王麗娜 王國力 李思佳 秦一冰 姜玉潔 馬金娜

(1遼寧中醫藥大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學一科/肺病一科,遼寧 沈陽 110032;2遼寧中醫藥大學)

調查表明,慢性阻塞性肺疾病發病率每年以10%趨勢上漲,目前已經成為全球排名第四位危害性疾病,慢性阻塞性肺疾病發病原因呈現多樣性,包括環境原因和自身原因〔1〕。慢性阻塞性肺疾病患者時常咳嗽、出現呼吸不順、胸口悶、易喘息等情況,會造成患者體內肺組織的改變,甚至波及氣道,使肺泡受到損傷,從而加快平滑肌細胞(ASMCs)功能的紊亂和失調,肺功能明顯降低〔2〕。而Janus激酶/轉錄激活子(JAK/STAT)信號傳輸路徑與慢性阻塞性肺疾病的發生密切有關,慢性阻塞性肺疾病患者JAK/STAT信號傳遞路徑異常活躍,STAT信號通路通過激酶反應增加活性使自己磷酸化,特定靶基因受到磷酸化的STAT影響,開始轉錄功能,并誘導相關蛋白,影響細胞增殖、分化和凋亡,抑制這一通路將成為治療慢性阻塞性肺病的新靶點〔3,4〕。加味二陳湯首次出現在《太平惠民和劑局方》中,具有中和理氣的作用,在改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能方面效果明顯〔5〕,但其作用機制尚不明確,本研究探討加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及ASMCs的作用機制。

1 材料和方法

1.1試驗藥物 加味二陳湯中含麻黃6 g、半夏、姜10 g、葶藶子10 g、茯苓15 g、地龍10 g、陳皮10 g、黨參10 g、白術10 g、苦杏仁10 g、山藥10 g、干姜5 g、甘草6 g,所有中藥購自安徽援康中藥材種苗生產有限公司,敲碎,上述藥物加4 800 ml蒸餾水浸泡20 min后常規煎煮1.5 h。過濾藥液,濾渣再煎煮1次,合并兩次濾液,濃縮至0.5、1.0、2.0 g/ml,貯存于4 ℃冰箱備用。根據人體給藥比例換算大鼠給藥比例〔6〕,將加味二陳湯分為5、10、20 g/kg 3個劑量給大鼠灌胃。

1.2動物 50只SPF級雄性大鼠(遼寧中醫藥大學實驗動物中心),體質量(255±16.26)g,6月齡,購自遼寧省動物實驗中心,許可證編號:SCXK(遼)2018-0001,飼養溫度為22～26 ℃,相對濕度40%～60%,黑白晝夜交替(均12 h),動物自由飲水與進食。本試驗經遼寧中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會批準審核(批件號:2019007)。

1.3試劑 Trizol試劑(浙江AMEKO公司,批號:15140-122 ),逆轉錄試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:K1622),STAT3抗體(艾美捷科技有限公司,批號:PAB7090),JAK3抗體(武漢恒意賽生物科技有限公司,批號:ELK4794),RT-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(上海優予生物科技有限公司,批號:HS0612-2),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司,批號:C0105),胎牛血清(FBS,美國GIBCO公司,批號:LOT#2036224C)。

1.4儀器 M276407 肺功能測定儀(北京中西華大科技有限公司),QTOWER2.2 PCR儀(西安歐拓機電設備有限公司),Chemi DocTMTouch imaging systerm凝膠圖像分析儀(成都百樂科技有限公司),BY/TD-3A離心機(北京海富達科技有限公司),RM2245石蠟切片機(德國萊卡公司);BX53型生物顯微鏡(奧林巴斯公司);1510酶標儀(賽默飛世爾有限公司)。

1.5方法

1.5.1動物建模 50只大鼠分為正常對照組、模型對照組、加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組,采用氣管內注入2次脂多糖(LPS)誘導+煙熏4 w建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型〔5〕,大鼠麻醉后仰臥固定并將1 μg/ml LPS 200 μl滴注入氣管中,注意防止窒息,持續給予2 w,同時準備熏箱將大鼠放入,熏香煙煙霧8支/次,每天2次,連續4 w,正常對照組不需建立慢性阻塞性肺疾病模型,僅給予生理鹽水灌胃,連續2 w。

1.5.2肺功能檢測 灌胃2 w后麻醉大鼠,將器官分離置入Y型管,兩端分別與流速、壓力傳感器連接,再連接至小動物呼吸機上,維持平靜呼吸3 min并連接Maclab數據分析系統,3 min后給予一定氣量充氣模仿深呼吸,利用微機處理計算大鼠肺功能指標包含用力呼氣量/用力肺活量(FEV0.3/FVC)、動態肺順應性(Cdyn)及呼吸指數(RI)。

1.5.3ASMCs細胞收集 肺功能測定完畢后,處理大鼠分離葉支氣管,剪成1 mm×1 mm消化后加入DMEM液,用200目過濾網過濾,離心,保留沉淀細胞,用100 U/ml青霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,精細分離處理得到大鼠氣道平滑肌塊,切碎后置入37 ℃培養箱中加入500 μl DMEM高糖+20% FBS的培養基,培養4 h,收集4～6代的細胞用于后續實驗。小鼠平滑肌α-肌動蛋白(actin),免疫細胞化學染色鑒定為ASMCs。

1.5.4HE染色 取肺組織標本采用標本刀切成4 mm的標本,采用甲醛固定60 min,進行脫水,浸蠟,制片,厚度為3～4 μm,蘇木素和伊紅染色液復染分別為6～8 min和10 s,與顯微鏡下觀察肺組織形態。按照Mikaw方法〔7〕對肺組織病理進行半定量評分,具體可分為4類:肺泡結構、肺上皮細胞、管腔情況及炎性細胞浸潤,其中0分為無病變、1分為輕度病變、2分為中度病變、3分為重度病變,各項評分之和為肺組織病理得分。隨機抽取各組北航醫學圖像分析管理系統截取圖片,測量其平滑肌的厚度,求其均值。

1.5.5RT-PCR檢測ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA表達 ASMCs細胞總RNA采用Trizol法來提取,總RNA提取反轉錄成 cDNA,按全說明書進行實驗,用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對JAK3、STAT3 mRNA表達水平進行檢測,qPCR引物由生工生物公司合成,內參采用GAPDH,60 ℃,10 min、95 ℃、72 ℃,各 30 s、95 ℃,5 min,循環40次,以ImageJ等軟件對結果進行分析,用相對定量2-ΔΔCt計算目的基因JAK3、STAT3 mRNA相對表達量。引物序列為:JAK3正向:5′-CTCCTTCCGAGC-CGTCAT-3′,反向:5′-CTCCCGCTGAGTCCT-3′;STAT3正向:5′-GCGGC-AGTTTCTGGCCCCTT-3′,反向:5′-CGGGCCACAATCCGGGCAAT-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)正向:5′-GGGAAACTGTGG-CGTGAT-3′,反向:5′-GAGTGGG TGTCGCTGTTGA-3′。

1.5.6Western印跡檢測ASMCs中JAK3、STAT3蛋白表達 ASMCs細胞加入100 μg的胰蛋白酶裂解30 min,10 000 r/min 4 ℃離心5 min,取上清液,用5×上樣緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中,按照4∶1的比例進行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。緩沖液配制好后要放入4 ℃冰箱內預冷,然后全部轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再把脫脂奶粉加入,全程封閉時長為1 h,然后加入一抗(稀釋比例1∶500,購自沈陽萬類生物科技有限公司)后,TTBS漂洗3 次,每次10 min;4 ℃過夜,加入辣根根過氧化物酶標記二抗(稀釋比例1∶2 500,購自沈陽萬類生物科技有限公司),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,加于膜上,使用Image-Pro Plus v6軟件分析JAK3、STAT3蛋白的相對表達量。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影響 與正常對照組比較,模型對照組肺功能顯著降低,FEV0.3/FVC、Cdyn值明顯降低,RI值明顯升高(P<0.001);加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組肺功能均明顯優于模型對照組,且加味二陳湯20 g/kg組肺功能改善最顯著(均P<0.05)。見表1。

表1 加味二陳湯對慢性阻塞性肺病大鼠肺功能、氣道平滑肌和ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達的影響

2.2加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道平滑肌的影響 與正常對照組比較,模型對照組氣道平滑肌厚度顯著提高(P<0.001);與模型對照組比較,加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組氣道平滑肌厚度均明顯降低,且加味二陳湯20 g/kg組大鼠氣道平滑肌厚度降低最顯著(P<0.05),提示慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道壁顯著增厚。見表1。

2.3加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達的影響 與正常對照組比較,模型對照組ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達明顯增加(P<0.001);與模型對照組比較,加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達明顯降低,且加味二陳湯20 g/kg組ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達降低更顯著(P<0.05)。見表1、圖1。

1～5:正常對照組、模型對照組、加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組圖1 加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠ASMCs中JAK3、STAT3 蛋白表達的影響

2.4加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織病理學觀察 正常對照組肺泡結構完整,無毛細血管出血、水腫、炎性細胞出現；模型對照組肺泡結構不完整,大小不均,肺組織間有輕微毛細血管充血,肺間質輕微水腫,肺泡腔也存在炎性細胞;而加味二陳湯20 g/kg組肺泡結構、毛細血管充血程度、肺間質水腫程度及炎性細胞浸潤明顯少于加味二陳湯5 g/kg組和加味二陳湯10 g/kg組。見圖2。正常對照組、模型對照組、加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組肺組織病理半定量評分為〔(1.17±0.23)分、(2.39±0.57)分、(1.91±0.52)分、(1.68±0.44)分、(1.36±0.31)分〕。與正常對照組相比,模型對照組肺組織病理半定量評分明顯升高(P<0.001);與模型對照組相比,加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組肺組織病理半定量評分均明顯降低(均P<0.05),且呈藥物依賴性。

圖2 各組肺組織病理學(HE染色,×200)

3 討 論

慢性阻塞性肺疾病是以氣流限制為特征的肺疾病,臨床上存在不完全可逆的進行性發展,對患者的生存質量及日常勞動造成巨大的影響,增加患者及家屬的心理和經濟負擔。研究表明,我國慢性阻塞性肺疾病患者逐年增多,2015年我國有33萬人患有慢性阻塞性肺疾病且因其死亡,已經成為危害我國國民身體健康的嚴重病癥之一〔8〕。慢性阻塞性肺疾病的發病原較為多樣且影響因素較多,有環境原因和自身原因,外在因素有長時間吸煙等,自身因素可能與家族遺傳有關系,因此采取有效方法治療慢性阻塞性肺疾病顯得至關重要〔9〕。

本研究說明,加味二陳湯可改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及氣道平滑肌厚度。FEV0.3/FVC是評價肺功能的重要指標,慢性阻塞性肺疾病存在肺組織病理學改變,因氣流阻塞、小呼吸指數增高、Cdyn下降,降低肺功能,RI是能夠反映肺通氣和氧交換功能,可作為評價呼吸功能減低的一個指數,參與慢性阻塞性肺疾病的進展。有研究發現,慢性阻塞性肺疾病大鼠平滑肌細胞增長較快,平滑肌增厚能夠影響慢性阻塞性肺疾病大鼠的氣道重塑,且與大鼠肺功能及Cdyn水平有顯著的關系〔10〕。李才元等〔11〕研究加味二陳湯能夠有效抑制體外培養的平滑肌細胞活性及有絲分裂反應,在慢性阻塞性肺疾病大鼠使用加味二陳湯進行治療可以有效控制氣管重塑,降低呼吸指數,改善FEV0.3/FVC水平。有研究通過體外建立哮喘小鼠模型,給予加味二陳湯干預,結果顯示小鼠氣道厚度、平滑肌面積等均有所改善,肺功能顯著提升,其通過轉化生長因子-β1及組蛋白去乙酰化酶2基因表達水平來實現抑制哮喘小鼠的氣道重塑的作用機制,且FEV0.3/FVC、呼吸阻抗及氣道重塑之間相輔相成,關系密切,說明加味二陳湯對于哮喘小鼠氣道重塑及肺功能改善有重要作用〔12,13〕。

相關研究證實,加味二陳湯通過氣道上皮細胞、ASMCs、局部炎癥細胞對慢性阻塞性肺疾病患者發揮治療作用,對氣道具有良好的局部抗炎癥作用,減輕患者氣道黏膜炎癥反應,改善平滑肌厚度,提高患者肺功能〔14〕。加味二陳湯中白術,可入脾經,發揮補脾、益陰的作用,亦能固精,白術可提高人的抗病能力,并可擴張血管促進血液循環,對急性或慢性炎癥有顯著的改善作用,而湯中地龍、黨參是擴張血管,促進血液循環的良藥提高機體免疫的良藥〔15〕。甘草首次出現在《神農本草經》中,書中記載了甘草的諸多藥用機制,如滋潤肺腑、清火氣、解毒,現代研究也證明甘草可防治肺炎、調節免疫等作用〔16〕。這與本研究相符。研究發現,慢性阻塞性肺疾病會造成患者體內肺組織的改變,甚至波及氣道使肺泡受到損傷,可以加快氣道〔17,18〕。JAK/STAT是機體內的一條重要通路,JAKs、STATs與平滑肌細胞的凋亡增殖分化有密切的關系,同時在不同細胞因子的刺激下異常活化,發生信號轉導而發生作用〔19〕。目前發現JAK主要有JAK1、JAK2、JAK3等,STAT是 JAKs的作用底物,有STAT1、STAT2、STAT3等多種表現形式。研究表明,慢性阻塞性肺疾病的發生發展和JAK/STAT信號通路的異常活化有關,慢性阻塞性肺疾病發生時JAK/STAT通路被激活,STAT的成分發生磷酸化,JAK/STAT通路殘端亞基附著形成二聚體進入細胞核,調控靶基因轉錄,與其他信號通路共同作用參與疾病發展〔20〕。STAT3蛋白是一種異常活躍的轉錄因子,通過與JAK3激酶反應增加活性使自己磷酸化,特定靶基因受到磷酸化的STAT3影響,開始轉錄功能,同時促進ASMCs增殖,加快氣道重塑反應〔21,22〕。氣道病變過程中JAK/STAT信號在ASMCs增殖中有重要作用,在機體細胞免疫、氣道反應中發揮重要職能,而加味二陳湯治療時能明顯提升慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能,能長期抑制氣道平滑肌的收縮,對氣道擴張作用持久〔23〕。余仙娟等〔24〕通過建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,給予保肺定喘干預后,結果表明保肺定喘湯可通過降低JAK、STAT1、STAT3表達水平來抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺血管重構,提高大鼠肺功能,降低呼吸指數〔24〕。JAK/STAT信號通路參與、調控多種組織、細胞、器官的生長發育,在炎癥反應中發揮重要作用,加味二陳湯中含有甘草、白術等多種中藥,對慢性阻塞性肺疾病有很好的治療效果,其作用機制可能與JAK-STAT信號通路活性受到抑制有關〔25,26〕。

綜上,加味二陳湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠有明顯治療作用,能顯著提高大鼠肺功能,其作用機制可能與抑制ASMCs中JAK/STAT信號活性有關。后期將通過給予JAK/STAT抑制劑進一步對慢性阻塞性肺疾病大鼠進行干預,探究加味二陳湯、JAK/STAT及慢性阻塞性肺疾病三者的作用機制。