杜仲調控miR-127-5p對骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥因子的影響

劉元豪 邢忠 許環順 肖平

(?？谑械谌嗣襻t院骨科,海南 ?？?571100)

骨關節炎是臨床常見的一種漸進性、退行性關節病變,其發病機制尚未闡明。目前研究發現軟骨細胞損傷是破壞軟骨組織的重要原因之一,炎癥與細胞凋亡等均可能造成軟骨細胞損傷。既往研究顯示植物提取物具有抗炎、抗氧化等作用,并可減輕軟骨細胞炎癥損傷,但其相關作用機制還不明確〔1～4〕。杜仲具有抗氧化、抑菌等作用,樹皮是主要用藥部位,研究表明杜仲可明顯抑制促炎細胞因子表達從而抑制氣道變應性炎癥〔5〕。miR-127-5p在骨關節炎軟骨細胞中呈低表達,上調其表達可通過靶向調控脂聯素(adipo)R1從而促進軟骨細胞增殖及抑制炎癥反應〔6〕。杜仲能否通過調控miR-127-5p發揮作用尚未可知。本研究探討杜仲調控miR-127-5p對人骨關節炎軟骨細胞HC-OA凋亡、增殖、細胞周期、炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 杜仲購自亳州市億弘堂藥業有限公司;人骨關節炎軟骨細胞HC-OA購自北京科瑞思博生物技術有限公司;DMEM培養基購自美國Gibco;白細胞介素(IL)-1β購自美國Sigma;Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen;anti-miR-NC、miR-127-5p inhibitor購自廣州銳博生物科技有限公司;反轉錄與熒光定量PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司;噻唑藍(MTT)試劑、凋亡檢測試劑購自北京索萊寶科技有限公司;IL-6、IL-1β檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2實驗分組 杜仲水提物制備〔7〕:稱取杜仲100 g,研磨成粉后加入70%乙醇(8倍量),加熱回流提取后減壓濃縮后干燥備用,濃度為10 g/ml,分別稀釋為0.01、0.10、1.00 mg/ml。HC-OA細胞調整濃度為1×105個/ml,將其接種于96孔板,每孔100 μl,添加IL-1β(10 ng/ml)培養24 h〔8〕,標記為IL-1β組;將常規培養的HC-OA細胞標記為Con組。添加含不同濃度(0.01、0.10、1.00 mg/ml)的杜仲培養液與10 ng/ml IL-1β培養24 h,分別為IL-1β+杜仲低劑量組、IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組。miR-127-5p inhibitor、anti-miR-NC轉染至HC-OA細胞后添加含1 mg/ml杜仲培養液培養24 h,依次為杜仲高劑量+miR-127-5p inhibitor組、杜仲高劑量+anti-miR-NC組。

1.3MTT檢測HC-OA細胞增殖 收集各組HC-OA細胞,加入20 μl MTT溶液,室溫培養4 h,3 000 r/min離心5 min,棄上清,加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO),5 min后用酶標儀測定490 nm處吸光度值(OD),并計算增殖抑制率〔(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%〕。

1.4細胞周期測定 收集各組HC-OA細胞,加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入預冷PBS重懸細胞(500 μl),加入預冷70%乙醇(3.5 ml),充分混勻后放入4 ℃冰箱內過夜,3 000 r/min離心棄上清,PBS洗滌后,向細胞沉淀中加入50 μl RNaseA,37 ℃水浴30 min后加入碘化丙啶(PI)染色液450 μl,4 ℃孵育30 min后上機檢測各階段細胞比例。

1.5流式細胞術測定HC-OA細胞凋亡率 向各組HC-OA細胞中添加預冷PBS,洗滌后棄上清,添加結合緩沖液500 μl重懸細胞,分別加入5 μl膜聯蛋白(Annexin) Ⅴ-FITC、PI,室溫孵育10 min,上熒光激活細胞分選(FACS)Calibur流式細胞儀檢測測定HC-OA細胞凋亡率。

1.6實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)測定miR-127-5p水平 Trizol法從各組HC-OA細胞中提取總RNA,檢測RNA濃度后,反轉錄成cDNA,反應條件:42 ℃ 15 min,95 ℃ 3 min,cDNA置于-20 ℃冰箱內保存。cDNA稀釋20倍后進行qRT-PCR。應用熒光定量PCR儀(羅氏LightCycler480)檢測miR-127-5p水平。

1.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6、IL-1β水平 收集各組HC-OA細胞上清液,嚴格按照ELISA試劑盒的說明檢測IL-6、IL-1β的水平。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1杜仲對HC-OA增殖的影響 與Con組比較,IL-1β組細胞存活率降低,G0-G1期細胞比例降低,S期細胞比例升高;與IL-1β組比較,IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組細胞增殖存活率升高,G0-G1期細胞比例升高,S期細胞比例降低,差異均有統計學意義,且呈劑量依賴性(均P<0.05),見表1。

表1 杜仲對HC-OA存活率、細胞周期的影響

2.2杜仲對HC-OA凋亡及miR-127-5p表達的影響 與Con組比較,IL-1β組細胞凋亡率升高,miR-127-5p表達降低;與IL-1β組比較,IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組細胞凋亡率下降,miR-127-5p表達升高,差異均有統計學意義,且呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1、表2。

圖1 杜仲對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響

表2 杜仲對HC-OA凋亡、miR-127-5p及炎癥因子表達的影響

2.3杜仲對HC-OA中炎癥因子水平的影響 與Con組比較,IL-1β組IL-6、IL-1β水平明顯增加;與IL-1β組比較,IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組上述指標的水平明顯降低(P<0.05),見表2。

2.4抑制miR-127-5p對杜仲作用的HC-OA增殖、凋亡的影響 與杜仲高劑量+anti-miR-NC組比較,杜仲高劑量+miR-127-5p inhibitor組細胞增殖存活率和G0-G1期細胞比例顯著降低,S期細胞比例和凋亡率顯著增高(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 抑制miR-127-5p對杜仲作用的軟骨細胞凋亡的影響

表3 抑制miR-127-5p對杜仲作用的HC-OA抑制率、細胞周期、凋亡及炎癥因子表達的影響

2.5抑制miR-127-5p對杜仲作用的HC-OA中炎癥因子表達的影響 與杜仲高劑量+anti-miR-NC組比較,杜仲高劑量+miR-127-5p inhibitor組IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05),見表3。

3 討 論

骨關節炎是一種致殘率較高的疾病,臨床主要采用西藥等方法進行治療,但西藥具有不良反應且部分患者對藥物易產生耐藥性,傳統中藥在治療骨關節炎方面可發揮重要作用,甘草素、黃芩素、牛膝醇提物等均可影響關節炎軟骨細胞凋亡、增殖等生物學行為〔9～11〕。

杜仲具有強筋骨、補肝腎等作用,其在治療骨關節炎方面作用重大,但其調控機制仍不明確〔12～14〕。本研究提示杜仲可抑制骨關節炎軟骨細胞增殖,并可誘導細胞周期阻滯于G0-G1期。本研究提示杜仲可促進骨關節炎軟骨細胞凋亡。IL-6、IL-1β屬于促炎因子,其在軟骨細胞中的水平升高可加重細胞炎癥損傷〔15,16〕。本研究提示杜仲可降低骨關節炎軟骨細胞炎癥反應的發生。

circRNA.33186通過充當miR-127-5p的海綿分子促進骨關節炎的發生〔17〕。circ_0136474、MMP-13通過與miR-127-5p競爭性結合來而抑制骨關節炎中的軟骨細胞增殖〔18〕。miR-127-5p調節骨橋蛋白的表達而介導人軟骨細胞增殖〔19〕。本研究提示杜仲可能通過提高miR-127-5p表達影響細胞進展。阻礙miR-127-5p表達可明顯逆轉杜仲對骨關節炎軟骨細胞周期、凋亡、增殖及炎癥反應的影響。