辛伐他汀對COPD大鼠肺組織半胱氨酸蛋白酶-3表達及細胞凋亡的影響

趙華棟 李君 朱勇

(錦州醫科大學附屬第三醫院,遼寧 錦州 121000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以老年人為主要發病人群的慢性氣流受限性疾病,目前其發病機制尚不完全清楚,有研究發現肺組織細胞凋亡參與COPD的發生發展過程,COPD患者肺組織細胞凋亡數量增加進一步導致了肺組織結構的破壞和肺氣腫的形成〔1〕。他汀類藥物已被證實能夠減輕COPD肺部及系統性炎癥反應,然而對COPD肺組織細胞凋亡的影響及其機制尚不十分明確。本研究通過鼻內滴注煙草提取物和氣管內滴入脂多糖(LPS)建立COPD模型,探討辛伐他汀對COPD大鼠肺組織細胞凋亡及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠,體質量(240±20)g 30只,購于錦州醫科大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(遼)2017-0003,喂養于該校實驗中心SPF級動物房。辛伐他汀膠囊(揚子江藥業集團四川海蓉藥業有限公司,生產批號:19122910),LPS(Eshefichia coli 055:B5,美國Sigma公司);黃山牌香煙(安徽中煙工業有限責任公司,每只含焦油量:10 mg,煙氣煙堿量:0.9 mg,煙氣一氧化碳量:11 mg);膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI,聯科生物)。

1.2實驗分組與建立模型 30只SD大鼠在動物房適應性喂養1 w后,隨機分為對照組、COPD組、辛伐他汀組,每組10只。對照組:每周經氣管內滴入生理鹽水0.2 ml兩次,余時間正常喂養;COPD組:在4 w內,每周5次經鼻滴入煙草提取物〔自制,方法為每次連續點燃10支黃山牌香煙,去過濾嘴,進氣口處的香煙煙霧在持續負壓下通過裝有4 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)的氣體收集瓶,待煙霧完全溶解后,用0.22 μm 的過濾器除去雜質和細菌,然后用氫氧化鈉調節pH至7.2～7.4。煙草提取物于每次實驗前30 min制備〕0.3 ml和每周2次經氣管內滴入LPS 0.2 ml,每次操作結束后,對照組和COPD組在相同的環境中喂養;辛伐他汀組:建立COPD模型方法同上,每次經鼻滴入煙草提取物后,給予辛伐他汀灌胃治療,5 mg/kg,余步驟同COPD組。

1.3標本采集 麻醉后將大鼠固定于平板后,暴露大鼠雙肺和心臟,將靜脈針插入右心室進行灌流,用生理鹽水沖洗,然后取出大鼠左肺,用4%多聚甲醛固定,待后面行蘇木素-伊紅(HE)染色;右肺用液氮迅速冷凍后-80 ℃保存,待需要時提取蛋白質。

1.4大鼠肺組織病理檢測 大鼠肺組織經4%多聚甲醛固定72 h后,制作石蠟標本后再行HE染色:脫蠟、染色、脫水透明、封片等,在顯微鏡下觀察肺組織病理變化并采集圖片。

1.5免疫組化法檢測大鼠肺組織中半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達 將制作的石蠟切片脫蠟水化后,用蒸餾水清洗后進行抗原熱修復、滅活內源性過氧化物酶、封閉,滴加一抗后放在4 ℃冰箱中過夜;第2天經洗滌后加二抗,然后放在37 ℃恒溫箱中40 min;二氨基聯苯胺(DAB)溶液滴加顯色數分鐘,蘇木素復染、脫水、透明、封片。以顯微圖像處理系統,對染色陽性物質(棕黃色顆粒)進行平均光密度值測定,以平均吸光密度值表示caspase-3的相對含量。

1.6Western印跡法檢測大鼠肺組織中caspase-3蛋白的表達 從-80 ℃的冰箱取出冰凍的組織,冰上緩慢解凍后,每組取肺組織組織約50 mg放入干凈EP管,剪碎組織加入200 μl裂解液和2 μl蛋白酶抑制劑,冰上靜置30 min后放在離心機上離心后取上清液至新的EP管,即為蛋白提取物,通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量計算出蛋白濃度,配制分離膠、濃縮膠后逐個加樣進行電泳(恒壓240 V,100 mA 30 min)、冰上電轉(恒流300 mA,約1 h)、常溫封閉(封閉液:2.5 g脫脂牛奶粉+50 ml TBST,1.5～2.0 h)、雜交、孵一抗搖床4 ℃過夜、孵二抗搖床上雜交1 h,最后進行電化學發光(ECL)顯影。

1.7流式檢測細胞凋亡 用70%的乙醇溶液將各組大鼠肺組織塊固定后,放在4 ℃保存。用生理鹽水將固定后的組織塊沖洗干凈后剪碎。放在100目的網上輕搓組織塊同時用 PBS沖洗后,收集沖洗液用300目的尼龍網過濾后,收集懸浮液,600 r/min離心10 min,將上清液吸除后,用PBS洗滌3 次后將細胞調整為每1 ml含105個細胞的懸浮液,取1 ml的細胞懸浮液,600 r/min離心10 min后加入結合緩沖液200 μl混合后,依次加入5 μl的PI和Annexin V-FITC,在避光條件下孵育20 min,加入200 μl的結合緩沖液,用500目的濾網過濾后60 min內用流式檢測細胞凋亡。

1.8統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組一般情況及體質量變化比較 造模前,3組大鼠活潑程度、呼吸狀態、毛發色澤及外界反應均無明顯差異;造模后,對照組活潑好動,呼吸正常,毛發光亮;COPD組、辛伐他汀組動作相對遲緩,反應慢,呼吸較急促,毛發褶皺。3組體質量在造模前無明顯差異(P>0.05)。造模后,COPD組和辛伐他汀組較對照組體質量均明顯降低(P<0.05),辛伐他汀組較COPD組體質量有增加,但差異無統計學意義。見表1。

表1 3組體質量變化

2.23組肺組織HE染色 對照組氣管壁和肺泡結構完整,形態規則, 周圍未見炎性細胞浸潤,肺血管壁無增厚。COPD組可見各級氣管、支氣管壁增厚,氣管有纖毛粘連、倒伏,周圍有炎癥改變,肺泡擴張,肺血管壁較對照組增厚。辛伐他汀組支氣管壁略增厚,結構較完整,肺泡擴張、肺血管壁增厚均較COPD組減輕。見圖1。

圖1 3組肺組織病理(HE染色,×400)

2.3免疫組化檢測各組肺組織中caspase-3平均吸光度 辛伐他汀組肺組織的caspase-3表達較COPD組顯著減少(P<0.05),而兩組caspase-3平均光密度均較對照組顯著增多(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 免疫組化檢測各組肺組織中caspase-3表達(HE染色,×400)

表2 各組肺組織 caspase-3平均光密度及蛋白表達和細胞凋亡率比較

2.4Western印跡檢測各組肺組織中caspase-3蛋白的表達 辛伐他汀組肺組織中caspase-3蛋白表達較COPD組顯著減少(P<0.05),且兩組均較對照組顯著增多(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 Western印跡檢測caspase-3在各組肺組織的表達

2.5流式細胞儀檢測各組肺組織細胞凋亡率 COPD組和辛伐他汀組肺組織早期細胞凋亡率較對照組明顯增加(P<0.05),而辛伐他汀組肺組織早期細胞凋亡率較COPD組顯著降低(P<0.05)。見表2、圖4。

3 討 論

COPD發病機制復雜,至今尚未完全清楚,除了肺部的慢性炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化應激等起重要作用外〔2～5〕,研究表明,細胞凋亡也可參與COPD的發生和發展過程,在COPD的發病機制中占有重要地位〔6,7〕。臨床研究發現,COPD急性加重可能與細胞凋亡增加有關,吸煙及慢性缺氧時可促進肺實質細胞的凋亡增加,同時機體氧化/抗氧化失衡也與細胞凋亡相關〔8〕。COPD患者體內同時存在著肺實質細胞和肺內炎性細胞凋亡異常,肺實質細胞凋亡異常引起COPD 患者肺實質破壞增加,從而導致肺內血管結構重建,而炎性細胞凋亡異常引起炎細胞的肺內異常浸潤并釋放炎性介質引起免疫損傷〔9〕。有動物研究發現,通過降低 COPD 小鼠的細胞凋亡率,能明顯提高免疫能力,縮短恢復期〔10〕。

caspase是細胞凋亡的核心,不同的刺激誘發凋亡過程激活的 caspase 不盡相同,但 caspase-3是caspase 級聯反應的最終效應子,是細胞凋亡的執行者。動物實驗表明,COPD大鼠模型細胞凋亡率和caspase-3表達均明顯升高〔11〕,在臨床研究中也發現COPD患者支氣管肺泡灌洗液的細胞凋亡指數及caspase-3的表達明顯高于健康志愿者〔12〕,由此推測caspase-3 在 COPD細胞增殖和凋亡的失衡中發揮著重要作用,最終導致 COPD 的發生發展。本研究結果與以上研究結論一致。

我們前期研究發現,辛伐他汀可以減輕COPD大鼠肺組織及全身炎癥反應,降低肺組織氧化應激損傷,改善COPD發生發展及預后〔13,14〕。辛伐他汀應用于臨床治療COPD急性加重期患者也能夠減輕炎癥反應,提高氧分壓及改善患者肺功能〔15〕。本研究結果表明,辛伐他汀能夠通過減少 caspase-3蛋白表達,減輕 COPD 大鼠肺組織細胞凋亡,為辛伐他汀在COPD的應用進一步提供了理論依據。