CircDUSP16調控肝癌細胞增殖和凋亡的機制

孔義華 王顯河 師海瑞 吳秋陽 梅艷 吳治平 戴志敏

(貴州醫科大學第二附屬醫院臨床檢驗中心,貴州 凱里 556000)

肝細胞癌(HCC)是全球最常見的肝原發性惡性腫瘤,也是癌癥相關死亡率第三大主要原因,嚴重威脅人們的健康和生命〔1,2〕。盡管有多種治療方式可用于治療HCC,例如手術切除或靶向治療等,但由于其腫瘤浸潤性,HCC通常被診斷為晚期,預后較差。手術切除后的復發和轉移與不良預后有關〔3〕。因此,檢測HCC早期新型生物標志十分必要〔4〕。大量證據表明,非編碼RNAs(ncRNAs)的表達與HCC進程有關〔5〕。環狀RNAa(circRNAs)是ncRNA的一種新亞型,具有共價的閉環結構,其反向剪接位點位于5′-3′端之間,并且比相應的線性RNAs對RNase R的抵抗力更高,具有更高的保守性〔6〕。circRNA在多種分子機制中起關鍵作用,包括腫瘤生物標志物、調控基因表達和使miRNA呈海綿狀〔7～9〕。微小RNA(miRNA)作為小型ncRNA的另一個亞組,負調控其靶基因,并在HCC中起癌基因或抑癌作用。研究表明,hsa_circ_0009910、hsa_circ_0049783和hsa_circ_0089172在HCC組織和血漿中上調,其表達增加與HCC患者的預后不良相關〔10〕。另有研究也證實,hsa_circ_0003855(circDUSP16)通過刺激miR-145-5p促進胃癌的發生和侵襲〔11〕,但在HCC中的作用未見報道。此外,miR-136-5p被報道在HCC中表達下調,作為抗癌miRNA,通過對各種通路的調節,影響肝癌的進展。

Yes相關蛋白(YAP)1過表達與HCC的血管浸潤、細胞分化、腫瘤大小和TNM腫瘤分期有關,可能是HCC形成的危險因素〔12〕。YAP1在人類HCC中高表達,其通過上調Jagged1和激活Notch途徑來促進HCC的發展和進程〔13〕。通過Circular RNA Interactome及Targetscan在線軟件預測發現miR-136-5p同時具有circDUSP16和YAP1的結合位點。并且,前期研究證實circDUSP16在HCC腫瘤組織中顯著高表達,且其表達與YAP1呈正相關;雙熒光素酶實驗證實miR-136-5p與circDUSP16和YAP1存在相互作用。因此,本研究旨在探討circDUSP16在肝癌中的表達特征并探討其與miR-136-5p和YAP1的潛在關系,以期為HCC患者提供預后生物標志物。

1 材料和方法

1.1細胞株 LO2細胞系(人類永生化的正常肝細胞系)和人類HCC細胞系(MHCC97、Huh7、SK-Hep1、Hep3B和HepG2)購自中國科學院。

1.2細胞培養 將細胞培養在含有100 U/ml青霉素(Sigma),100 μg/ml鏈霉素(Sigma)和10%胎牛血清(Gibco, Thermo Fisher Scientific)的DMEM(Gibco, Thermo Fisher Scientific)中,并在含5%CO2的潮濕氣氛中保持在37 ℃。

1.3細胞轉染 慢病毒介導的sh-circDUSP16(靶序列:ACCTGCTTGCAGGCTTTCAGT),質粒介導的circDUSP16,miR-136-5p模擬物(mimic),miR模擬對照(NC),miR-136-5p抑制劑(inhibitor)和miR抑制劑對照(inhibitor NC)購自Genomeditech(上海,中國)。根據制造商說明,在轉染之前,將HCC細胞種植在6孔板中24 h,然后在HCC細胞中融合。將Lipofectamine2000試劑(Invitrogen,美國)用于細胞轉染測定。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 根據制造商說明,使用RNAiso Plus試劑盒(Takara)從HCC細胞中提取總RNA,使用RNAiso試劑盒(Takara)提取miRNA。為了評估circDUSP16、miR-136-5p和YAP1在HCC細胞系中的表達水平,進行qRT-PCR分析。使用PrimeScript RT Reagent試劑盒(Takara)通過逆轉錄總RNA,合成提取總RNA的互補DNA(cDNA);使用Mix-X miRNA第一鏈合成試劑盒(Takara)合成miRNA的cDNA;使用SYBR Premix Ex Tap(Takara)進行qPCR,并在LightCycler 480Ⅱ(Roche,Switzerland)中擴增。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)用作內源對照。使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達。

1.5細胞活力、菌落形成和凋亡 根據制造商說明,使用四甲基偶氮唑藍(MTT)分析0、24、48和72 h細胞活力。使用分光光度計評估每個樣品在450 nm處的吸光度(OD)值。為了評估菌落形成,在轉染后48 h將低細胞密度接種到培養皿中,并形成可見的菌落,然后用1%結晶紫染色后對菌落計數。將細胞以5×105個細胞/孔的密度鋪在6孔板中,并且當細胞生長至對數生長期時,收獲細胞并計數。離心后,通過添加195 μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)結合溶液重懸細胞。加入5 μl膜聯蛋白V-FITC和10 μl碘化丙啶染色溶液以混合。將細胞在黑暗中孵育10～20 min,然后進行流式細胞儀分析。

1.6Western印跡法 RIPA緩沖液(Beyotime,中國上海)用于提取細胞中的蛋白質。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒確定蛋白質濃度,并使用上樣緩沖液使蛋白質變性。蛋白樣品(20 μg)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中電泳,并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,美國)上。用5%脫脂牛奶封閉,然后與特異性一抗在4 ℃下孵育過夜?？贵w是抗YAP1(1∶1 000,目錄號ab52771,Abcam)和抗GAPDH(1∶3 000,目錄號5174S,Cell Signaling Technology)。將膜與二抗在室溫下孵育2 h。增強化學發光試劑〔PierceTM電化學發光(ECL),Thermo ScientificTM,美國〕用于檢測蛋白質。

1.7熒光素酶報告基因檢測 將HCC細胞系接種到24孔板中。孵育24 h后,將含有野生型(WT)或突變體(MUT)circDUSP16和YAP1的3′非翻譯區(UTR)的報告載體與miR-136-5p mimic共轉染到Huh7和Hep3B細胞系中。轉染48 h后,使用Luc-Pair TM雙熒光素酶測定試劑盒(Genecopoeia)定量熒光素酶活性。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件和GraphPad Prism進行獨立或配對t檢驗及方差分析(ANOVA);Pearson相關分析用于分析相關性;Kaplan-Meier方法和對數秩檢驗分析生存曲線。

2 結 果

2.1circDUSP16在不同HCC細胞系中表達水平 qRT-PCR結果表明,與LO2正常細胞系circDUSP16相對表達量(1.00±0.12)比較,HCC細胞系MHCC97(1.34±0.23)、Huh7(2.76±0.14)、SK-Hep1(1.84±0.16)、Hep3B(2.81±0.26)及HepG2(2.43±0.28)顯著升高(t=2.27、16.53、7.27、10.95、8.13;P=0.07、<0.001、0.001、<0.001、<0.001)。

2.2抑制circDUSP16可抑制HCC細胞的增殖并促進凋亡 與sh-NC組比較,sh-circDUSP16組circDUSP16基因表達水平明顯降低(1.00±0.09 vs 0.35±0.05,t= 10.94,P<0.001;1.00±0.11 vs 0.42±0.08,t=7.39,P<0.001),說明轉染成功。通過在Huh7和Hep3B細胞系中轉染sh-circDUSP16發現,相比于sh-NC組,sh-circDUSP16顯著抑制了Huh7和Hep3B細胞系在48 h和72 h的細胞活力(均P<0.05),抑制菌落形成并促進細胞凋亡(均P<0.05)。見表1、圖1、表2。

A.在Huh7和Hep3B細胞系中轉染sh-circDUSP16后對細胞菌落數的影響。B.在Huh7和Hep3B細胞系中轉染sh-circDUSP16后對細胞凋亡的影響圖1 抑制circDUSP16可抑制HCC細胞的增殖并促進凋亡

表1 轉染sh-circDUSP16后對肝癌細胞活力的影響

表2 轉染sh-circDUSP16后對肝癌細胞菌落數和凋亡的影響

2.3circDUSP16在HCC中靶向miR-136-5p miR-136-5p與circDUSP16的3′UTR結合位點見圖2。將miR-136-5p mimic和WT、MUT circDUSP16共轉染到Huh7和Hep3B細胞系中,發現miR-136-5p顯著降低了Huh7和Hep3B細胞系中WT circDUSP16的熒光素酶活性(均P<0.001),但在MUT circDUSP16中沒有改變(均P>0.005)。見表3。

圖2 miR-136-5p與circDUSP16的3′UTR結合位點

表3 轉染miR-136-5p mimic后對肝癌細胞WT、MUT circDUSP16及YAP1 WT、MUT熒光素酶活性的影響

2.4circDUSP16和miR-136-5p調控HCC中Hippo/YAP信號通路 miR-136-5p與YAP1的3′UTR結合位點見圖3。將miR-136-5p mimic和YAP1 WT、MUT共轉染到Huh7和Hep3B細胞系中,發現miR-136-5p顯著降低了Huh7和Hep3B細胞系中YAP1 WT的熒光素酶活性(均P<0.05),但在YAP1 MUT中沒有改變(均P>0.05)。過表達Huh7和Hep3B細胞系中miR-136-5p后,與mimic-NC組比較,miR-136-5p mimic組miR-136-5p表達明顯升高(P<0.001);而抑制Huh7和Hep3B細胞系中miR-136-5p后,與Inhibitor NC組比較,miR-136-5p inhibitor組miR-136-5p表達明顯下降(P<0.001),見表4。Western印跡結果表明,過表達miR-136-5p可以降低細胞中YAP1表達,而抑制miR-136-5p可以增加細胞中YAP1表達。見圖4。

圖3 miR-136-5p與YAP1的3′UTR結合位點

表4 過表達或抑制miR-136-5p后對肝癌細胞中miR-136-5p表達影響

1～4:mimic-NC組、miR-136-5p mimic組、Inhibitor NC組、miR-136-5p inhibitor組;圖5同圖4 Western印跡檢測Huh7和Hep3B細胞系中YAP1表達

2.5circDUSP16通過靶向miR-136-5p/YAP1調控HCC細胞增殖和凋亡 在Huh7和Hep3B細胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p表達,Western印跡結果表明,轉染sh-circDUSP16降低細胞中YAP1表達,而抑制miR-136-5p可以逆轉YAP1表達,見圖5。MTT分析發現,sh-circDUSP16顯著降低Huh7及Hep3B細胞系48、72 h細胞活力,而抑制miR-136-5p可以顯著逆轉細胞活力(均P<0.05)。見表5。此外,菌落分析和流式分析表明,sh-circDUSP16顯著抑制Huh7及Hep3B細胞系菌落形成并促進細胞凋亡,而抑制miR-136-5p可以顯著逆轉這些變化(均P<0.05)。見圖6、圖7、表6。

圖5 Western印跡法檢測Huh7和Hep3B細胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后YAP1表達

圖6 在Huh7和Hep3B細胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對細胞菌落數的影響(結晶紫染色)

圖7 在Huh7和Hep3B細胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對細胞凋亡的影響

表5 同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對肝癌細胞活力的影響

表6 同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對肝癌細胞菌落數和凋亡的影響

3 討 論

越來越多的證據表明,circRNAs可作為HCC患者潛在的生物標志物〔14～16〕。例如,在具有較高體脂比的HCC患者中,circ-DB表達上調,而circ-DB抑制miR-34a,激活泛素特異性蛋白酶(USP)7/細胞周期蛋白(Ciclin)A2信號傳導途徑,加速腫瘤生長并減少DNA損傷〔17〕。TWIST1通過增加CIRC-10720表達,從而促進上皮-間質轉化(EMT)在HCC波形蛋白表達〔18〕;circ-ADD3通過細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)1介導的泛素化促進zeste基因增強子同源物(EZH)2降解,從而抑制HCC細胞的轉移〔19〕。本研究發現,抑制circDUSP16表達可抑制HCC細胞的增殖并促進凋亡,可能通過競爭性結合miR-136-5p,調控YAP1的表達,進而參與HCC進展。這些結果表明,circDUSP16可能是HCC的潛在生物標志物。

在功能上,circRNA可以充當HCC中的癌基因或抑癌基因。一方面,環狀RNA同源結構域相互作用蛋白激酶(circ_HIPK)3、circ_UBXN7和circ-PRKCI促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,并加速HCC細胞的凋亡〔20～22〕。另一方面,circZKSCAN1抑制HCC細胞的腫瘤發生和侵襲〔23〕。但是,circDUSP16在HCC中的功能作用仍不清楚。本研究發現,抑制circDUSP16表達可抑制Huh7和Hep3B細胞系的增殖并促進凋亡。這些研究表明,circDUSP16可能是HCC細胞中的腫瘤促進因子。

MiRNA參與各種生理和病理過程〔24～26〕。據報道,多種miRNA調節癌細胞的惡性生物學行為,包括HCC在內的多種癌癥的增殖、遷移、凋亡、自噬,耐藥性和血管生成〔27～29〕。miR-136-5p是miRNA(非編碼RNA家族)的成員,可以通過使目標mRNA的3′-非翻譯區沉默來調節靶基因,從而抑制或促進腫瘤發生和發展〔30〕。研究表明,miR-136-5p在上皮性卵巢癌和神經膠質瘤細胞系中的表達下調〔31,32〕,而在非小細胞肺癌中miR-136-5p被上調〔33〕。此外,miR-136-5p可以促進化療誘導的神經膠質瘤細胞凋亡〔31〕。根據上述研究,miR-136-5p可能在不同的癌癥中異源表達。本研究發現,在HCC細胞系中miR-136a-5p表達下調。與預期一致,證明circDUSP16靶向HCC細胞中miR-136-5p表達。

在當前研究中,YAP1被確定為miR-136a-5p的靶標。YAP1在Hippo信號通路中起著重要作用,該通路是細胞增殖、凋亡和器官生長調節中必不可少的通路〔34〕。YAP1也據報道參與了癌癥的發展,因為它可以促進細胞增殖、抑制細胞凋亡并誘導癌細胞的EMT和耐藥性〔35〕。這項研究發現,YAP1是circDUSP16和miR-136-5p的靶基因。miR-136-5p過表達降低了YAP1表達水平,而抑制miR-136-5p增加了YAP1表達水平。此外,轉染circDUSP16可以增加YAP1表達水平,而miR-136-5p的異位表達逆轉了這一變化,并進一步影響HCC細胞的增殖和凋亡。這些數據表明,circDUSP16通過靶向miR-136-5p/YAP1調控HCC細胞增殖和凋亡。

綜上,circDUSP16的異位表達通過競爭性結合miR-136-5p,從而調控YAP1的表達,參與HCC進展。本研究可能為HCC患者提供預后生物標志物。