棗ZjWRKY22 基因克隆、亞細胞定位及表達載體構建

張雪慧 ，張鵬飛 ，劉亞令 ，梁晉軍 ，溫鵬飛

（1.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801；2.山西石樓紅棗科技小院，山西 石樓 032500；3.山西農業大學 生命科學學院，山西 太谷 030801）

壺瓶棗（Ziziphus jujuba‘Huping Zao’）為鼠李科棗屬植物，具有皮薄肉厚、味甜汁多的優點，其果實中富含糖、脂肪酸、氨基酸、礦物質、維生素、多酚和其他抗氧化劑[1]。由于壺瓶棗的成熟期常處于雨季，裂果現象普遍存在[2]，嚴重者可達90%以上[3]，嚴重阻礙傳統棗主產區的發展[4]。棗裂果屬于生理性病害，是由于果實的內部生長與外界環境不協調而導致的果實表面開裂的一種現象[5]，該病害不僅影響其外觀品質，且開裂果實易發生不同程度的貯藏病害[6]。

WRKY 是在各種應激下可誘導表達的轉錄因子，廣泛參與植物對各種生物（植物病原體和昆蟲防御）[7]和非生物（鹽、干旱、冷害和機械損傷）[8-9]脅迫的響應過程，其表達具有快速、即時和組織特異性[10]。WRKY 保守結構域包含60 個氨基酸，N 端含WRKYGQK 保守序列，與DNA 結合活性相關；C 端具有一個典型的鋅指結構，一般由C2H2或C2HC 組成，參與蛋白質互作和輔助DNA 結合[11]。目前，該基因家族中ZmWRKY114[12]、MsWRKY42[13]、AtWRKY22[14-15]、GhWRKY22[16-17]等成員已被鑒定，其中過表達ZmWRKY114的轉基因植株中，ZmWRKY114在ABA 介導參與鹽脅迫反應途徑中起負調控作用[12]。紫花苜蓿MsWRKY42對多種逆境脅迫均有響應，且基因誘導表達的豐度較高，表明該基因參與了多種非生物逆境脅迫調控[13]。擬南芥中異源過表達苜蓿MfWRKY22增強了擬南芥的非生物脅迫耐受性[14]。在擬南芥中，AtWRKY22參與暗誘導衰老信號轉導通路[15]。過表達GhWRKY22的轉基因擬南芥中JA 生物合成相關基因表達上調，JA 抑制基因JAZ1和JAZ8的表達下調[16-17]。

目前，棗WRKY基因研究主要集中在棗瘋病以及果實發育[18-21]，而當果實遭受非生物脅迫時WRKY 的分子調控機理研究相對較少。山西農業大學園藝學院棗課題組在前期利用RNA Seq 測序技術，檢測分析壺瓶棗裂果與正常果基因表達的總體差異，采用生物信息學技術對測序結果進行分析[4]，結果顯示，ZjWRKY22基因在參與水分脅迫調控方面差異表達。因此，本試驗以壺瓶棗為材料，對ZjWRKY22進行克隆，對序列進行系列生物信息學分析和亞細胞定位觀察以及構建植物超表達載體，旨在為進一步明確基因功能、揭示棗裂果發生的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗以壺瓶棗（Ziziphus jujuba‘Huping Zao’）為材料，種植于山西農業大學園藝站。于2021年6—9 月采集壺瓶棗棗吊、莖、葉、花及不同發育時期果實，迅速放入液氮中，-80 ℃冰箱保存備用。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種植于溫度25 ℃、光照時數16 h/8 h、光照強度15 000 lx 的人工智能培養箱。

1.2 試驗方法

1.2.1ZjWRKY22基因克隆利用FastPure?Universal Plant Total RNA Isolation Kit（RC411）試劑盒提取壺瓶棗果實總RNA，測定OD260/OD280值經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格。采用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒去除基因組DNA，完成反轉錄，合成cDNA 第1 條鏈。根據轉錄組中ZjWRKY22核苷酸序列在NCBI 中進行Blast 查找CDS 序列進行克隆。采用Primer 5.0 設計試驗所需引物（表1）。

表1 試驗所用引物Tab.1 The primer sequence in this study

反應體系為1 μL cDNA，0.4 μL 引物，5 μL 2×pfu mix，ddH2O 補足至10 μL；反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59.8 ℃退火54 s，72 ℃延伸90 s，共34 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根）回收目的片段與PMD-19T 連接，熱激法轉化至大腸桿菌感受態Trans5α。挑選菌液PCR 檢測陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。采用質粒小提試劑盒（天根）提取測序驗證構建正確的質粒pMD-ZjWRKY22，便于后續試驗。

1.2.2 基因生物信息學分析 利用CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.Cgi）進行ZjWRKY22 蛋白保守結構預測；利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）進行蛋白基本理化特性分析；利用SPOMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和 SWISS-MODEL（https：//swiss-model.expasy.org/interactive）對其編碼氨基酸序列進行二級結構和三級結構預測；利用SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行信號肽和跨膜結構域預測；通過NCBI 官網進行Blastp 比對，下載高相似度的序列并結合MEGA 7.0 軟件構建系統進化樹；利用DNAMAN 軟件進行同源比對。

1.2.3ZjWRKY22表達情況分析 提取壺瓶棗棗吊、莖、葉、花及果實總RNA，經反轉錄合成cDNA，參照2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix（SYB?Rgreen，with anti-Taq）試劑盒進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。每個樣本設置3 個生物學重復。利用2-ΔΔCt[19]計算ZjWRKY22在壺瓶棗不同組織部位及不同發育時期果實的相對表達量。

1.2.4 ZjWRKY22 蛋白亞細胞定位分析 提取構建成功的pMD-ZjWRKY22質粒，將pMDZjWRKY22和 pCAMBIA1300-35S-GFP 使用KpnI 和XbaI 同時進行雙酶切，基因片段與載體片段摩爾比為3∶1 進行16 ℃過夜連接，轉化至Trans5α。利用Kana 篩選陽性克隆pCAM?BIA1300-GFP-ZjWRKY22載體，參照說明書，采用凍融法將pCAMBIA1300-GFP-ZjWRKY22轉化至農桿菌GV3101 中，同時以pCAMBIA1300-35S-GFP 為對照。涂布于LB（含50 ng/mL Kan+25 ng/mL Rif）平板上，倒置于28 ℃培養箱培養2 d；挑取陽性單克隆至1.5 mL 液體LB 中，28 ℃、200 r/min 過夜培養，轉移至20 mL 液體LB 培養基擴大培養至OD600為0.5～0.6；5 000 r/min 8 min，室溫收集菌體；使用MES 重懸至OD600=1.0，室溫黑暗靜置2～3 h；注射4 周齡煙草葉片背部，25 ℃，黑暗12 h 后正常培養2 d。采用打孔器在侵染葉片上選取4～6 個葉圓片進行制片；隨后在激光共聚焦顯微鏡下檢察綠色熒光信號。

1.2.5ZjWRKY22超表達載體構建 根據pCAMBIA-35S-1300 載體信息以及ZjWRKY22基因序列設計外掛酶切位點引物對1300-F-XbaI和1300-R-KpnI，以pMD-ZjWRKY22 質粒為模板進行PCR 擴增。PCR 產物連接pMD-19T 克隆載體并轉化大腸桿菌感受態細胞Trans5α測序。提取驗證正確的克隆載體pMD-1300-ZjWRKY22質粒DNA。經KpnI 和XbaI 對pMD19T-ZjWRKY22和pCAMBIA-35S-1300 進行雙酶切，ZjWRKY22基因片段插至pCAMBIA-35S-1300 中，過夜連接獲得重組pCAMBIA-1300-ZjWRKY22質粒并轉入大腸桿菌Trans5α感受態細胞中。

2 結果與分析

2.1 ZjWRKY22 基因克隆

以壺瓶棗果實cDNA 為模板，經PCR 擴增后，擴增產物用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，克隆載體測序結果表明（圖1），該序列長度與NCBI公布的序列（MG493485.1）相符，其片段大小為1 068 bp。

圖1 ZjWRKY22 基因克隆Fig.1 ZjWRKY22 gene cloning

2.2 基因序列生物信息學分析

根據轉錄組基因序列信息，使用NCBI 在線Blast 工具，基因登錄號LOC107431286，該基因CDS 序列長1 068 bp，編碼355 個氨基酸。NCBI 上CDD 預測結果表明，該基因含有典型的WRKY 結構域，證明屬于WRKY 家族。利用ExPASy 網站在線工具對ZjWRKY22編碼蛋白的基本理化特性進行分析，結果表明，該蛋白分子質量約為38.9 ku，等電點為5.92，分子式為C1682H2582N472O568S13，脂肪指數為44.82，不穩定系數為66.41，表明該蛋白為不穩定蛋白質。該蛋白中絲氨酸最多，占18%，其次蘇氨酸、脯氨酸占8.5%，最少的是色氨酸，占1.1%。通過SPOMA 網站對ZjWRKY22編碼氨基酸序列進行二級結構預測，結果顯示，結構類型占比為無規則卷曲66.20%，α-螺旋18.87%，β-折疊10.99%，β-轉角3.94%。為了進一步研究蛋白空間結構，使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）對三級結構進行同源建模，預測該蛋白的結構域主要由4 個β-折疊組成，分別為WRKYGQK、RGYYR、RKQVER、FIVTYT（圖2）。利用在線軟件SignalP-5.0 進行信號肽預測，顯示該蛋白無信號肽。TMHMM 進行跨膜結構域預測，結果表明，該蛋白不具有跨膜結構域。NetPhos 3.1 服務器使用預測真核蛋白中的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸磷酸化位點，預測該蛋白含有76 個磷酸化位點。

圖2 ZjWRKY22 一級（A）、二級（B）和三級（C）結構Fig.2 The first structure（A），the second structure（B）and the tertiary structure（C）of ZjWRKY22

為了解ZjWRKY22大致的進化關系，從NCBI數據庫中篩選出與ZjWRKY22基因編碼蛋白同源性較高的12 種植物的WRKY 蛋白序列，包括楊梅（Morella rubra）、美國山核桃（Carya illinoinensis）、甜櫻桃（Prunus avium）、桃（Prunus persica）、扁桃（Prunus dulcis）、蘋果（Malus domestica）、酸棗（Ziziphus jujubeMill.var.spinosa）、胡楊（Populuseuphratica）、毛果楊（Populus trichocarpa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、梅（Prunus mume）和可可（Theobroma cacao），同時利用MEGA 7.0 軟件構建與棗同源度較高的物種間的系統進化樹（圖3），發現棗ZjWRKY22與酸棗聚為一小分支，表現為親緣關系越近同源性越高。

圖3 同源序列比對（左）與系統進化分析（右）Fig.3 Homologous sequence alignment（left）and phylogenetic analysis（right）

2.3 ZjWRKY22 基因不同組織及果實發育時期表達特性

基于實時熒光定量PCR，分析ZjWRKY22在壺瓶棗不同組織部位及果實發育時期的相對表達情況，該基因在壺瓶棗各組織部位均有表達，但表達量存在差異，果實中的表達量顯著高于其他組織，在全紅期果實中的表達量最高（圖4）。

圖4 不同組織部位及果實發育時期特異性表達分析Fig.4 Specific expression analysis of different tissues and fruit development periods

2.4 亞細胞定位

利用Predict Protein 在線分析預測ZjWRKY22蛋白可能定位于細胞核內。為驗證其結果，使用含綠色熒光蛋白（GFP）的植物表達載體pCAMBIA1300-GFP-ZjWRKY22（圖5），注射本氏煙草。結果顯示，在瞬時表達pCAMBIA1300-GFP-ZjWRKY22融合蛋白的煙草葉片細胞中，僅在細胞核檢測到熒光信號；而單獨表達pCAMBIA1300-35S-GFP 的對照細胞，熒光信號在整個細胞分布（圖6）。可見，ZjWRKY22 蛋白屬于核定位蛋白，這與其作為轉錄因子發揮功能相吻合。

圖5 pCAMBIA1300-35S-ZjWRKY22 載體構建Fig.5 pCAMBIA1300-35S-ZjWRKY22 vector construction

圖6 ZjWRKY22 亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of ZjWRKY22

2.5 ZjWRKY22 超表達載體構建

重組質粒pCAMBIA-1300-ZjWRKY22連接轉化后在Kana 抗性培養基上篩選培養，使用引物1300-F-XbaI 和1300-R-KpnI 對陽性單菌落進行特異性擴增，將獲得目的條帶的陽性菌液（圖7）送至上海生工測序，并保存用于后續將載體轉化至農桿菌中進行植株侵染。

圖7 pCAMBIA-1300-ZjWRKY22 陽性克隆鑒定Fig.7 pCAMBIA-1300-ZjWRKY22 positive cloning identification

3 結論與討論

在秋季多雨的年份，許多棗主產區的品種，因降雨使得水分進入果實，導致棗裂果現象普遍發生[21]。植物遭受水分脅迫逆境，其體內會發生一系列變化以適應逆境，一些相關抗逆基因也會大量表達，來感應并傳導逆境脅迫信號[22]。其中，WRKY基因家族在植物響應生物和非生物脅迫的過程中發揮關鍵作用，它作為高等植物中最大的轉錄因子（TFs）家族之一，通過調控植物激素信號轉導途徑響應逆境[23]。WRKY基因參與植物的生長發育和對外界環境的抗性[24]，然而目前針對棗WRKY基因在細胞中作用及其功能研究鮮有報道。薛寶平等[25]對棗的92 個WRKY 家族基因進行了系統鑒定分析。前期課題組研究發現，ZjWRKY22轉錄因子在水分脅迫逆境中出現高豐度差異表達，說明該基因可能在調控脅迫響應中發揮關鍵作用，但其作用機制目前尚不清楚。

本研究成功克隆了壺瓶棗ZjWRKY22基因，該基因CDS 序列長1 068 bp，共編碼355 個氨基酸，屬于WRKY GroupⅡe 組，這與之前的報道相符[25]。因此，為了進一步研究其功能，本研究采用熒光定量PCR 分析了ZjWRKY22基因的組織表達特性，結果表明，該基因在果實中相對表達量較高，推測其在果實生長發育中發揮著重要的作用，這與枇杷中的同源WRKY 的研究結果相一致[26]。蛋白質在細胞中的定位決定了其行使功能的部位，生物信息學預測ZjWRKY22 定位在細胞核中，本試驗構建亞細胞定位載體pCAMBIA1300-GFP-ZjWRKY22并瞬時轉化煙草葉片，經共聚焦顯微鏡觀察并確定了ZjWRKY22 蛋白定位于細胞核上。該結果與已報道的WRKY 轉錄因子的亞細胞定位結果一致[27-29]。前人研究表明，WRKY 廣泛參與植物對逆境的抗性反應[30]，而且WRKY 家族中每個基因的功能各異。近年來，利用轉基因技術解析WRKY基因調控植物非生物脅迫下生物學功能的研究已有較多報道[31-32]。本研究構建了植物超表達載體pCAMBIA-1300-ZjWRKY22，為進一步探究在脅迫下ZjWRKY22提高植物代謝增強抗性的作用提供重要的理論依據，也為探索ZjWRKY22的生物學功能打下了堅實的基礎。