苜蓿卷葉病毒山西苜蓿分離物外殼蛋白基因序列分析

杜 江 ，王晨燕 ，崔麗艷 ，馬海會 ，姚東作 ，王德富 ，牛顏冰

（1.山西農業大學 生命科學學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 草業學院，山西 太谷 030801）

苜蓿（Medicago sativaL.）是一種在世界范圍內被廣泛種植的豆科牧草，因其富含蛋白質、維生素等多種營養成分，素有“牧草之王”的美譽[1]。我國超過2 000 a 的苜蓿栽培史已經充分說明，苜蓿是一類產量高、固氮效果好和適應性強的牧草[2-4]。苜蓿具有廣泛的生態適應性，目前已經是黃土高原的當家牧草，在我國農牧業生產建設中發揮著巨大作用[1,5-6]。

隨著我國苜蓿產業高速發展，苜蓿種植面積逐年增長，苜蓿病毒病也越來越嚴重。苜蓿病毒病不僅影響了苜蓿的產量，還嚴重降低了苜蓿的品質。目前，已發現危害苜蓿的病毒病原約有47 種，其中主要病毒病原有：苜蓿花葉病毒（Alfalfa mosaic virus，AMV）、苜蓿卷葉病毒（Alfalfa leaf curl virus，ALCV）、白三葉草花葉病毒（White clover mosaic virus，WCMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）等[7-8]。

ALCV 屬雙生病毒科（Geminiviridae）大戟潛隱病毒屬（Capulavirus）成員[9]，其基因組為單組分，大小約為2.7 kb，由蚜蟲傳播[10-11]。ALCV 已在中東地區、阿根廷、法國、西班牙、意大利、突尼斯等地區和國家被檢測到，但是目前我國對于該病毒的研究仍然相對匱乏[9]。2019 年ALCV 首次在河南省苜蓿樣品中被檢測到[12]。隨后，在2022 年有研究者通過高通量測序技術發現，采集于甘肅、內蒙古、陜西、河南省苜蓿樣品中檢測到了ALCV[13]。

筆者于2021 年5 月在山西農業大學植物園內發現許多苜蓿葉片出現卷曲、皺縮的癥狀。為明確引起苜蓿卷曲和皺縮癥狀的病原，本研究通過利用雙生病毒通用引物對采集的苜蓿疑似病毒病樣品進行分子鑒定，結果在苜蓿樣品中檢測到ALCV 的侵染，這是首次在山西省內苜蓿樣品上檢測到該病毒；同時對ALCV 山西苜蓿分離物（ALCV-Taigu）外殼蛋白基因全序列進行了克隆和系統進化分析，旨在明確其分類地位，為進一步獲得ALCV 山西苜蓿分離物的全序列奠定一定基礎，也為山西苜蓿病毒病的防治工作提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 供試苜蓿樣品于2021 年5月在山西省晉中市太谷區山西農業大學植物園（37°25′N、112°34′E）采集，主要癥狀為葉片出現卷曲、皺縮現象（圖1）。

圖1 苜蓿癥狀Fig.1 Symptoms of alfalfa

1.1.2 試劑及儀器 主要試劑為TaqDNA poly?merse（TransGen Biotech 公司）、DNA 回收試劑盒（TransGen Biotech 公司）、pMD18-T（TaKaRa 公司），主要儀器為基因擴增儀（Bio-RAD 公司）、凝膠成像儀（Bio-RAD 公司）、臺式離心機（Eppendorf公司）和電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 病毒及衛星分子檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法[14]提取樣品的總DNA，利用已報道的引物SPG1/SPG2[15]和β01/β02[16]分別對雙生病毒DNA-α 和DNA-β 進行檢測（表1）。20 μL PCR 擴增體系：樣品DNA 2 μL、PrimeSTAR HS 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各1 μL，加雙重蒸餾水至20 μL。PCR 擴增程序：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s（SPG1/SPG2 引物）或90 s（β01/β02 引物），共30 個循環；72 ℃再延伸5 min。

表1 研究使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 ALCV 外殼蛋白的克隆

根據1.2 中的測序結果，參考文獻設計特異性引物ALCV-CPF/ALCV-CPR（表1）擴增ALCV外殼蛋白全長序列[16]。PCR 擴增體系和擴增程序同1.2。

1.4 ALCV 外殼蛋白序列分析

利用DNA 凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收目標條帶，將回收的條帶連接至pMD18-T（TaKaRa 公司）載體并轉化至Trans5α化學感受態細胞（TransGen Biotech 公司）。通過菌落PCR 鑒定后隨機挑選4 個陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測序。測序結果利用BLAST 工具檢索相關同源序列；使用SDT 1.2 和MEGA 7.0 軟件對病毒ALCV-CP基因序列進行同源性比較和進化分析。

2 結果與分析

2.1 苜蓿病樣病毒檢測

以提取的苜蓿樣品DNA 為模板，利用雙生病毒通用引物（SPG1/SPG2）進行PCR 擴增，得到大小約為900 bp 的目的條帶，而健康葉片中未擴增到相應條帶（圖2）。通過BLAST 比對發現，目的片段測序結果與已報道ALCV 相似性最高，為97.5%～99.3%，表明侵染苜蓿的病毒為苜蓿卷葉病毒，將其命名為ALCV-Taigu，而使用β 衛星通用引物未擴增到目的條帶。

圖2 通用引物SPG1/SPG2 擴增結果Fig.2 Amplification result of universal primers SPG1/SPG2

2.2 苜蓿卷葉病毒外殼蛋白序列擴增

利用特異引物（ALCV-CPF/ALCV-CPR），以提取的苜蓿樣品DNA 為模板，對ALCV 外殼蛋白CP基因進行PCR 擴增，得到大小約為735 bp 的目的條帶，而健康樣品中未擴增出相應大小的片段（圖3）。

圖3 CP 特異引物PCR 擴增結果Fig.3 PCR amplification result of CP specific primer

2.3 ALCV-Taigu 與其他ALCV 分離物相似性比較

對ALCV-Taigu 的CP基因與來自阿根廷、西班牙、伊朗、突尼斯、法國、意大利和中國的48 個ALCV 株系進行核苷酸和氨基酸的相似性進行比較，分析結果表明，ALCV-TaiguCP基因與ALCV其他株系核苷酸同源性為82.7%～96.6%；進一步分析顯示，ALCV-TaiguCP基因與來自中國不同地區和阿根廷的ALCVCP基因相似性較高，為95.0%～96.6%，而與來自黎巴嫩、意大利、西班牙、法國、伊朗等地的ALCVCP基因相似性為82.7%～83.5%（圖4）。ALCV-TaiguCP基因編碼的氨基酸同源性為82.4%～97.1%，進一步分析表明，ALCV-TaiguCP基因編碼的氨基酸與來自中國不同地區和阿根廷的ALCVCP基因編碼的氨基酸相似性較高，相似性為95.1%～97.1%，而與來自黎巴嫩、意大利、西班牙、法國、伊朗等地的ALCVCP基因編碼的氨基酸相似性為82.4%～84.8%（圖5）。以上結果說明，本研究中ALCVTaigu 分離物可能來自于國內其他地區或者是阿根廷。

圖4 ALCV-Taigu CP 核苷酸相似性比對結果Fig.4 Pairwise nucleotide sequence identity of ALCV-Taigu CP

圖5 ALCV-Taigu CP 氨基酸相似性比對結果Fig.5 Pairwise amino acid sequence identity of ALCV-Taigu CP

2.4 ALCV-Taigu 的系統發育分析

為了進一步明確ALCV-Taigu 的分子進化關系，利用MEGA 7.0 對ALCV-Taigu 的CP基因所編碼的氨基酸序列與已報道的其他ALCV 分離物進行系統發育分析，結果如圖6 所示，ALCV-TaiguCP與分離物ALCV-Helinger/N1 親緣關系最近，聚為一簇；從整個進化分析來看，ALCV-TaiguCP與中國和阿根廷ALCV 分離物聚集為一個大支；而與法國、西班牙、意大利等歐洲國家和黎巴嫩、伊朗等中東國家的ALCV 分離物不在一個分支，說明距離較遠。可以推斷，山西ALCV 可能是由國內其他地區或是阿根廷傳入。

圖6 ALCV-Taigu CP 基因編碼產物系統發育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of product coded by ALCV-Taigu CP gene

3 結論與討論

苜蓿是全球最為重要的豆科飼料作物之一，是一類具有極高營養價值的牧草，對畜牧業生產系統、農業生產系統以及未來人類食品和工業直接使用的潛力都極為重要[2]。而苜蓿病毒病的分布也十分廣泛，在世界上種植苜蓿的地區幾乎都存在苜蓿病毒侵染的現象。

有研究人員在美國紐約市開展的苜蓿病毒病害調查中發現，AMV、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）和CMV 的檢出率分別為41.9%、6.6%和6.7%[17]。在阿根廷，菜豆卷葉病毒（Bean leaf roll virus，BLRV）在紫花苜蓿中的發病率已超過50%[18]。有研究者發現，在沙特阿拉伯苜蓿種植地區檢測到了AMV、BLRV、CMV 以及WCMV 的侵染[19]。MASSUIM 等[20]在伊朗田間種植的紫花苜蓿中檢測到了AMV、BLRV、花生矮化病毒（peanut stunt virus，PSV）和BYMV 等4種不同的苜蓿病毒。周其宇等[21]通過田間調查和酶聯免疫檢測的方法，對甘肅省蘭州市的紫花苜蓿病毒病的癥狀類型、病原種類和寄主范圍進行了研究，發現紫花苜蓿病毒病在蘭州市的發病率為43.3%。KUMARI 等[22]在約旦、黎巴嫩、敘利亞和突尼斯收集的上百份苜蓿樣品中首次檢測到了ALCV。隨后DAVOODI 等[23]首次在伊朗種植的苜蓿上檢測到ALCV 的存在。我國直到2019 年才在河南省種植的苜蓿上檢測到該病毒[12]。

伴隨著我國農牧產業的蓬勃發展，對苜蓿需求量也在逐年增長，截至2015 年，我國苜蓿種植面積已達約472 萬hm2[13]。苜蓿病毒不僅導致苜蓿產量降低，更是會致使苜蓿品質變劣，因此，對苜蓿病毒病的防控迫在眉睫。2021 年在山西農業大學植物園進行病害調查時，發現部分苜蓿出現葉片卷曲、皺縮的癥狀。遂利用雙生病毒檢測引物對感病苜蓿進行分析鑒定，確定其受到ALCV 的侵染，這是首次在山西省境內苜蓿上檢測到該病毒的存在。

ALCV 是雙生病毒科大戟潛隱病毒屬成員，該病毒侵染苜蓿后會導致苜蓿出現斑駁、皺縮、矮化和花葉等癥狀。有研究發現，當在苜蓿中檢測到ALCV 侵染時，常常伴隨有AMV 的復合侵染現象[13]。本研究同樣在采集的苜蓿樣品中利用PCR技術同時檢測到了AMV 的侵染，表明本研究中的苜蓿樣品是被病毒復合侵染。DAVOODI 等[9]通過系統發育分析發現，ALCV 最有可能起源于伊朗，并在中東多樣化，然后傳播到地中海盆地，后再傳播到阿根廷。

本研究發現，能夠引起山西晉中地區苜蓿卷曲、皺縮癥狀的病毒中含有ALCV，這是首次在山西境內種植的苜蓿上檢測到該病毒的侵染。通過對ALCV-TaiguCP全序列進行相似性和系統進化分析發現，山西晉中分離物ALCV-Taigu 與我國分離物Helinger/N1 親緣關系最近，聚為一簇。本研究結果將會從分子進化方面為ALCV 的有效防治提供一定的理論依據。