毛果楊多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP 的生物信息學分析

劉海靜，田 星，王 露，宮海豐，殷 涵，劉浩寧，包玉英

（內(nèi)蒙古大學 牧草與特色作物生物學教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

細胞壁是植物細胞抵抗病原微生物的第一道屏障，果膠作為細胞壁中嵌入纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)的主要基質(zhì)，是富含半乳糖醛酸的復雜多糖混合物，在細胞間黏附和信號轉導中發(fā)揮重要作用[1-2]。病原菌感染寄主早期階段分泌的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG，EC 3.2.1.15）能夠降解果膠的主要成分多聚半乳糖醛酸，導致宿主細胞分離和組織浸漬，是病原菌重要的致病因子[3-6]。植物細胞壁中的防御蛋白——多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP）可以特異性識別和抑制病原菌PG[7-10]，從而抑制果膠降解；此外，PGIP 對PG 的抑制作用有利于寡半乳糖醛酸（Oligogalacturonide，OG）片段的形成，激發(fā)植物抗毒素和木質(zhì)素的積累、防御相關基因的表達以及活性氧的產(chǎn)生，從而進一步提高植物抗病性[11-13]。

植物PGIP基因在基因組上多以串聯(lián)重復排列[9]，基因家族未經(jīng)歷大規(guī)模擴張，成員在2～16 個不等，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有2 個成員，水稻（Oryza sativa）中有7 個成員，油菜（Brassica napus）中有16 個成員[14-16]。除個別成員包含一個較短內(nèi)含子外，大多數(shù)PGIP基因無內(nèi)含子[9]。雖然同一物種不同成員基因序列具有高度相似性，但它們在植物的不同生長發(fā)育階段以及應對不同病原菌或逆境因子時，其表達量都有顯著差異[17-19]。與許多抗性基因一樣，PGIP 蛋白屬于胞外型富含亮氨酸重復（Leucine-rich repeat，LRR）蛋白亞類，序列中包含10 個相對保守的LRR 序列，每個重復序列有24 個殘基，形成2 個β-折疊，其中一個β-折疊占據(jù)PGIP 蛋白質(zhì)凹面內(nèi)側，含有與PG 相互作用的關鍵殘基[20-22]。

目前，木本植物PGIP基因特征和功能的研究還較少，僅在蘋果、梨、柑橘等果樹物種中開展[23-25]，林木PGIP基因功能的研究還非常欠缺。楊樹是林木研究的模式樹種，也是我國重要的工業(yè)用材、園林景觀和生態(tài)造林樹種，具有重要的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益。本研究通過生物信息學技術鑒定毛果楊（Populus trichocarpa）中PGIP基因家族，對其基因序列、理化性質(zhì)及結構、系統(tǒng)進化、基因表達譜進行分析，旨在探究PtPGIP基因家族的功能，為楊樹抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 PtPGIP 基因序列搜索與鑒定

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/tools/index.jsp）中獲取擬南芥（Arabidopsis thaliana）PGIP基因AtPGIP1（Locus_AT5G06860）和AtPGIP2（Locus_AT5G06870）。以其蛋白序列為模板，在Phytozome v13（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）數(shù)據(jù)庫中利用TBLASTN 對毛果楊（Populus trichocarpa）基因組數(shù)據(jù)庫進行同源搜索，獲得序列通過NCBI Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫進行保守結構域分析。

1.2 PtPGIP 基因克隆與分析

本研究所用毛果楊采自瑞典于默奧大學校園。將采集的毛果楊枝條在營養(yǎng)土中扦插培養(yǎng)3 個月，采用天根植物總RNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China）提取毛果楊根、莖、葉、芽的總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量。利用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0反轉錄試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）將上述總RNA 反轉錄為cDNA。

由于PtPGIP1基因是假基因，不對其進行克隆?；谒阉鳙@得的楊樹PtPGIP2～PtPGIP4基因序列，用SnapGene 2.3.2 設計基因克隆引物（表1）。以毛果楊根、莖、葉、芽的混合cDNA 為模板，采用TaKaRa ExTaq擴增毛果楊PGIP基因，PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 2 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，割膠后，采用天根瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒純化回收目的條帶（Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China）。將純化后的DNA片段分別與克隆載體pEASY-T3（TransGen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China）連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞Transl-T1，利用含有卡那霉素的固體LB 培養(yǎng)基進行篩選。每個基因挑取6 個白色菌落，采用天根2×TaqPCR 預混試劑進行菌落PCR 檢測，每個基因選擇3 個陽性克隆進行雙向測序。

表1 PtPGIP 基因克隆引物Tab.1 Cloning primers of PtPGIP genes

對毛果楊PGIP 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點、脂溶性、穩(wěn)定性（https://www.expasy.org/proteomics）、N-糖基化位點（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）、跨膜結構域（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）、亞細胞定位（https://predictprotein.org/）以及大腸桿菌中表達產(chǎn)物的溶解性（http://www.biotech.ou.edu/）進行預測，綜合分析蛋白質(zhì)的性質(zhì)與功能。采用PipMaker program（http://www.bx.psu.edu/miller_lab/）和TBtools 軟件對擬南芥和毛果楊PGIP基因進行染色體共線性分析[26-27]。

1.3 系統(tǒng)進化分析

以擬南芥和毛果楊PGIP 蛋白序列為模板，在Phytozome v13 數(shù)據(jù)庫中利用TBLASTN 對小立碗蘚（Physcomitrium patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）、水稻（Oryza sativa）、高梁（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）基因組數(shù)據(jù)庫進行同源搜索。將獲得的所有物種的PGIP 蛋白序列通過MAFFT v7 進行氨基酸序列多重比對，比對結果在BioEdit 中進行手動校對。利用 MEGA 10.0 的JTT 模型、最大似然法（ML）（Bootstrap 值為l 000)，構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 PtPGIP 蛋白結構預測

采用SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）進行蛋白質(zhì)信號肽預測。一級結構、二級結構采用PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）和PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html）進行分析。三級結構分析采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/），選取PGIP 晶體結構1ogq.1.A.pdb 作為模板進行同源建模。PtPGIP 與PghAxc 和PghBxc 的蛋白分子對接則選取Cluspro 2.0（https://cluspro.bu.edu/login.php?redir=/home.php）進行模擬，選擇結合自由能最低的對接模型進行進一步分析[28]。然后用PyMOL v2.3 軟件進行圖像處理。

楊樹潰瘍病是由病原菌黃單胞菌引起的，是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高、發(fā)病較廣、危害較大的楊樹病害。因此，選擇黃單胞菌多聚半乳糖醛酸酶PghAxc 和PghBxc[29]作為蛋白對接配體與PtPGIP進行分子對接模擬。

1.5 PtPGIP 基因的表達特征

為了研究PtPGIP基因的表達模式，在ePlants（http://bar.utoronto.ca）中檢測了毛果楊的表達譜。標準化基因表達水平以log2轉化值表示。然后基于PtPGIP基因的表達水平，使用TBtools 為每個基因構建表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 PtPGIP 基因序列特征

經(jīng)保守結構域分析并排除冗余序列后，在毛果楊基因組中共鑒定出4 個PGIP基因，依據(jù)在染色體排列順序依次命名為PtPGIP1、PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4。經(jīng)克隆測序結果與NCBI 數(shù)據(jù)庫序列完全一致。由表2 可知，cDNA 全長765～981 bp，編碼254～328 個氨基酸，分子質(zhì)量28.19～36.13 ku，等電點6.38～9.06，均為穩(wěn)定的疏水蛋白，脂溶性好，定位于細胞外，具有3～7 個N-糖基化位點，但這些蛋白在大腸桿菌中原核表達后均不可溶。

表2 毛果楊PGIP 基因基本信息Tab.2 Basic information of PGIP genes in P.trichocarpa

將毛果楊PGIP基因定位到染色體上，PtPGIP1和PtPGIP2是位于6 號染色體上的串聯(lián)重復基因，PtPGIP3和PtPGIP4是位于16 號染色體上的串聯(lián)重復基因。通過染色體共線性分析發(fā)現(xiàn)，這2 個串聯(lián)重復是來自于毛果楊的一次全基因組重復（WGD）事件，且與擬南芥5 號染色體上的2 個PGIP基因（串聯(lián)重復）直系同源（圖1）。表明毛果楊PGIP 基因家族起源于一條染色體上分化程度較高的2 個串聯(lián)重復PGIP基因，經(jīng)全基因組重復（WGD）事件進行了家族擴張。

圖1 擬南芥和毛果楊PGIP 基因共線性Fig.1 Collinearity of AtPGIP and PtPGIP

2.2 PGIP 基因家族的系統(tǒng)進化分析

用MAFFT v7 和BioEdit 對毛果楊PGIP基因進行多重序列比對發(fā)現(xiàn)（圖2），PtPGIP1基因序列763 bp 處胞嘧啶（C）缺失導致開放閱讀框中終止密碼子（TGA）提前出現(xiàn)，翻譯中斷，使其成為一個假基因（基因片段）。通過插入缺失的胞嘧啶來修正PtPGIP1基因序列，用于系統(tǒng)進化分析（圖3）。通過基因克隆，獲得了毛果楊PGIP2～PGIP4基因序列。對基因序列相似性進行分析，結果顯示，PtPGIP1與PtPGIP4序列相似性較高，達89.5%；PtPGIP2與PtPGIP3序列相似性較高，達90.7%；而PtPGIP1/4與PtPGIP2/3序列間的相似性低于79%。

圖2 不同物種PGIP 的氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequences alignment between PGIP from different species

圖3 PGIP 基因家族系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PGIP gene family

從代表不同進化歷史的小立碗蘚（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）、水稻（Oryza sativa）、高梁（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出PGIP基因。最終確定水稻、高梁、玉米和大豆PGIP 基因家族分別包含7、5、3、5 個成員，小立碗蘚和江南卷柏基因組數(shù)據(jù)庫中沒有匹配度較高的PGIP基因。將獲得的這些PGIP蛋白序列與PtPGIP一起進行序列相似性分析、多重序列比對（圖2）與系統(tǒng)進化分析（圖3）。結果顯示，這幾種植物的PGIP 蛋白序列相似性為21.0%～92.5%，相同或相近物種的PGIP 相似性較高。毛果楊和擬南芥PGIP 進化關系很近（Group Ⅰ），且與雙子葉植物大豆PGIP（Group Ⅱ）聚在一起，而其他幾種單子葉植物（水稻、高梁、玉米）的PGIP 則聚成進化關系較近的2 支（Group Ⅲ和Group Ⅳ），說明單子葉植物和雙子葉植物PGIP 形成2 個分離的進化支。

2.3 PtPGIP 蛋白結構分析

由圖4 可知，PtPGIP 蛋白均含有信號肽，長度在19～20 個氨基酸，除PtPGIP1 具有7 個LRR（Leucine-rich repeat）片段外，PtPGIP2～PtPGIP4蛋白均包含10 個LRR 片段，表明它們均具有典型的PGIP 結構域。LRR 片段中存在保守的xxLxLxx序列，其中，L 為亮氨酸或脂肪族氨基酸殘基，x 為任意氨基酸。PtPGIP 蛋白質(zhì)二級結構由α-螺旋、β-折疊和隨機卷曲組成，其中，隨機卷曲占比最多（表3）。在蛋白序列的N-端和C-端，PtPGIP1 含有6 個半胱氨酸，PtPGIP2～PtPGIP4 均含有8 個半胱氨酸。這些半光氨酸非常保守，可形成二硫鍵，對于穩(wěn)定蛋白空間結構起著重要作用。

圖4 PGIPs 一級結構Fig.4 Primary structure of PGIPs

表3 PtPGIP 蛋白質(zhì)結構預測Tab.3 Structure prediction of PtPGIP proteins

利用SWISS-MODEL 同源建模的方法預測PtPGIP 的三級結構，結果顯示，PtPGIP1 由于缺失突變只保留了PGIP 一部分三級結構，參與預測的氨基酸數(shù)、氨基酸覆蓋率比PtPGIP2～PtPGIP4 低，但PtPGIP1 和模板的相似性與PtPGIP2～PtPGIP4差異不大，均在45%左右。總體來看，PtPGIP2～PtPGIP4 蛋白質(zhì)三維結構相似度較高，它們由α-螺旋、隨機卷曲、β-折疊組成的線圈狀結構形成一個特定的凹面（圖5-A）。將模擬的 PtPGIP2-4 結構與黃單胞菌多聚半乳糖醛酸酶PghAxc 和PghBxc進行蛋白質(zhì)分子對接，獲得的對接模型并不完全一致，表現(xiàn)出一定差異性，但對接結果均顯示PtPGIP的凹面與PghAxc 和PghBxc 的裂隙區(qū)部位進行緊密結合，說明該部位是二者的互作區(qū)域（圖5-B）。

圖5 PtPGIP 蛋白質(zhì)三維結構模擬Fig.5 Three dimensional structure simulation diagram of PtPGIP proteins

2.4 PtPGIP 基因表達模式

為了研究PtPGIP基因的表達模式，在ePlants中分析了毛果楊的表達譜，基于PtPGIP基因的表達水平，使用TBtools為每個基因構建表達熱圖（圖6），PtPGIP3的表達數(shù)據(jù)未能查到，PtPGIP1、PtPGIP2、PtPGIP4基因在各組織部位的表達水平如圖6 所示，結果表明，PtPGIP1基因在各個組織部位的表達水平均較低，PtPGIP2和PtPGIP4基因在根、幼苗、花序中的表達量高于葉片、木質(zhì)部，尤其是PtPGIP2基因在花序中的表達量最高。

圖6 PtPGIP 基因表達模式Fig.6 Expression pattern of PtPGIP genes

3 結論與討論

PGIP 是一種來自LRR 超家族的細胞壁結合蛋白，可特異性抑制病原菌產(chǎn)生的PG，在植物病原菌抗性中發(fā)揮重要作用[30]。植物中，PGIP基因以基因家族的形式存在，成員為幾個或十幾個，基因家族未經(jīng)歷大規(guī)模擴張。在染色體上，PGIP基因多以串聯(lián)重復排列，如擬南芥AtPGIP1和AtPGIP2是位于5 號染色體上間隔507 bp 的串聯(lián)重復基因[31]，菜豆PvPGIP1～PvPGIP4分布在染色體50 kb區(qū)域內(nèi)[32]，水稻OsPGIP1～OsPGIP4分布在5 號染色體短臂的30 kb 區(qū)域內(nèi)[16]。本研究鑒定的4 個毛果楊PGIP基因形成位于6 號和16 號染色體上的2 個串聯(lián)重復基因簇。這種抗性相關基因在基因組中串聯(lián)重復排列非常常見，這有利于植物在各種環(huán)境中生存[33]。與大多數(shù)植物PGIP基因一樣，毛果楊PTPGIP1～PtPGIP4基因均不含內(nèi)含子。PtPGIP1基因序列由于缺失突變導致開放閱讀框提前終止，成為一個假基因，表明楊樹PGIP基因家族存在假基因化過程。KALUNKE 等[18]曾對古多倍體植物大豆（Glycine max）的PGIP基因家族進行研究，發(fā)現(xiàn)家族中存在活躍的假基因化現(xiàn)象。正如NBSLRR 基因的進化一樣，最近復制的PGIP基因簇可以為新基因進化提供一個遺傳變異庫[34]。系統(tǒng)進化上，毛果楊和擬南芥PGIP 聚在一起，且與雙子葉植物大豆進化關系很近，而水稻、高粱、玉米等單子葉植物的PGIP 聚成進化關系較近的2 支。盡管相同或相近物種的PGIP 相似性較高，但也可能來自不同祖先。有些PGIP 種內(nèi)遺傳差異較大，如OsPGIP6 與其他幾個成員的氨基酸序列相似性僅有25.3%～29.2%，說明即便是同一物種不同家族成員也可能是獨立起源的[19]。

與其他防御相關基因家族一樣，PGIP 家族基因表達具有組織和器官特異性，不同成員在表達模式上表現(xiàn)出差異性。如菜豆PvPGIP1在幼葉、下胚軸、根和莢中均不表達，PvPGIP2卻在所有器官中表達，PvPGIP3和PvPGIP4則只在根中微量表達[35]。水稻OsPGIP7在成株期葉鞘中表達量較高，OsPGIP2和OsPGIP4在穗期葉鞘中表達量較高，而OsFOR1則在2 個生長時期葉鞘中表達量較高[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，毛果楊PtPGIP1、PtPGIP2和PtPGIP4基因在不同組織部位的表達水平也具有較大的差異。表明植物PGIP基因的表達水平與其生長發(fā)育時期和組織部位相關。此外，PGIP基因表達水平還可以受到外源因素，如機械損傷、外源物質(zhì)、生物和非生物逆境脅迫等誘導[31,35-39]。

植物PGIP 家族成員存在功能冗余和亞功能化現(xiàn)象，目前已進化出多種類型的PGIP 來抵御病原菌感染[40-41]。絕大多數(shù)PGIP 蛋白包含10 個LRR片段，片段中存在保守的xxLxLxx 序列。蛋白質(zhì)三級結構形成的螺旋狀結構具有特定凹面，負責與病原菌PG 之間的蛋白互作。研究發(fā)現(xiàn)，單個氨基酸的變化會導致PGIP-PG 互作發(fā)生顯著改變，影響PGIP 的抑制活性[42-43]。因此，暴露的LRR 序列對PGIP 的親和力和特異性至關重要[19,44]。本研究中，PtPGIP2-4蛋白序列LRR片段中的保守序列xxLxLxx表現(xiàn)出較大差異，它們與黃單胞菌多聚半乳糖醛酸酶的蛋白質(zhì)對接結果并不完全一致，這可能是由于PtPGIP2-4 在楊樹中發(fā)生了功能分化，使其能更有效地抵御各種病原菌侵害或更快地應對各種環(huán)境脅迫，但具體作用機制還有待進一步研究。

本研究從毛果楊基因組中鑒定出4 個PGIP基因，對它們進行了基因序列、系統(tǒng)進化分析，預測蛋白質(zhì)的結構和功能，并分析基因表達譜，結果顯示，毛果楊PGIP基因家族起源于同一條染色體上分化程度較高的2 個串聯(lián)重復基因，經(jīng)全基因組重復（WGD）事件進行了家族擴張，后經(jīng)歷了假基因化和亞功能化。家族成員在基因表達模式上具有組織特異性，蛋白質(zhì)序列及分子對接均體現(xiàn)出差異性。推測楊樹PGIP基因家族發(fā)生了功能分化，使其在應對多種逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。