生物被膜在白念珠菌病的研究進展

唐詩琴，李小靜

長期以來，以白念珠菌（Candida albicans）為主的真菌感染威脅著人類的健康，特別是免疫缺陷的群體。隨著越來越多抗真菌藥物及免疫抑制劑的使用，白念珠菌的耐藥也成為了一個嚴(yán)重的問題，而導(dǎo)致這種情況最重要的一個因素就是生物被膜（Biofilm）的形成。生物被膜存在于包括植物和哺乳動物組織在內(nèi)的天然基質(zhì)上，并易在人造聚合物上形成，如在導(dǎo)管、假體和植入的心臟瓣膜中被發(fā)現(xiàn)［1］。正因為白念珠菌生物被膜的存在，所以白念珠菌相關(guān)感染疾病對臨床抗真菌藥物有很大的耐藥性，增加了白念珠菌感染的復(fù)發(fā)率，使臨床治療也變得困難。因此，需要尋找新的治療靶點去降低白念珠菌病的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率。

1 生物被膜的形成

生物被膜是一群附著在生物或非生物基質(zhì)上的微生物，嵌入細(xì)胞外聚合物基質(zhì)中，是許多微生物的主要生長狀態(tài)。白念珠菌生物被膜的形成主要由酵母細(xì)胞、假菌絲和菌絲通過表面接觸粘附而形成的一種復(fù)雜網(wǎng)狀混合物的三維結(jié)構(gòu)［2］。白念珠菌生物被膜的發(fā)育是漸進的，生物被膜的形成常分為4 個階段（圖1）：白念珠菌酵母細(xì)胞在底物上的吸附，形成基底層（基底層起錨定作用）、微菌落的形成和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的產(chǎn)生，成熟階段，細(xì)胞從成熟生物被膜中的分散［3］。生物被膜內(nèi)的假菌絲與菌絲細(xì)胞形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，不斷向周圍延伸擴散。

1.1 生物被膜與粘附 粘附是生物被膜初步形成的第一步，而生物被膜完整性是整個生物被膜形成重要的第一步。在粘附過程中，單個酵母細(xì)胞一般會粘附在物體表面，啟動生物被膜形成的階段。此時的酵母細(xì)胞還可以重新回到浮游狀態(tài)，所以在這個階段，生物被膜的形成是相對可逆的。在粘附過程中有兩個重要物質(zhì)：轉(zhuǎn)錄因子與黏附素。白念珠菌中研究最多的黏附素家族是Als（Agglutinin-like sequence，凝集素樣序列）蛋白家族，Als 蛋白家族是白念珠菌生物被膜形成和發(fā)展的基礎(chǔ)，Als1、Als3 和Als5 在白念珠菌與宿主細(xì)胞相互粘附過程中發(fā)揮著重要作用；Als1除了在粘附中的作用外，還對真菌細(xì)胞大小有一定影響［4］。Hwp1、Rbt1、Eap1 和Ywp1 都是糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl phosphatidyll inositol，GPI）錨定細(xì)胞壁蛋白，其中Hwp1 是重要的粘附因子，它是菌絲特異性細(xì)胞壁蛋白，能調(diào)控生物被膜中的菌絲形成，并且促進白念珠菌與宿主細(xì)胞的粘附［5］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Als3 或Hwp1 基因缺失的時候，生物被膜形成的能力受到抑制，可導(dǎo)致毒力減弱［6，7］。通過與浮游細(xì)胞狀態(tài)進行比較后，確定了3 個新的生物被膜形成的調(diào)節(jié)因子：Flo8、Gal4 和Rfx2［8］。在生物被膜形成全程中都需要Flo8 因子的參與，而在中期發(fā)育中需要Gal4 和Rfx2 因子的參與才能形成較完善的生物被膜，靶向白念珠菌中的Flo8 因子會引起針對多種微生物感染的保護性免疫反應(yīng)。在將來，生物被膜調(diào)節(jié)因子與黏附素家族的進一步研究有希望成為治療白念珠菌感染的一種方法。

1.2 生物被膜與菌絲 白念珠菌和其它真菌不同之處在于它可以在各種條件下形成酵母細(xì)胞和菌絲，菌絲是生物被膜形成的重要成分［9］。在生物被膜形成過程中，一些核心調(diào)節(jié)因子比如Efg1、Ndt80、Rob1和Tec1 均參與了浮游細(xì)胞的生長［10］，但是懸浮培養(yǎng)中的菌絲，容易形成有缺陷的菌株，不利于生物被膜形成，這些調(diào)節(jié)因子有促進菌絲形成的作用，若將它們在浮游條件下培養(yǎng)，其中一個基因缺失，都會抑制或降低白念珠菌的菌絲形成，進一步影響生物被膜［11］。在菌絲調(diào)控中有2 個重要的信號途徑，包括MAPK（Mitogen-activated protein kinase，絲裂原激活蛋白激酶）信號途徑、cAMP-PKA 信號途徑。Cek1是一種胞外信號調(diào)節(jié)激酶，是MAPK家族的重要成員，它能參與調(diào)控細(xì)胞表面接觸反應(yīng)，在菌絲侵入性生長以及生物被膜形成中發(fā)揮一定的作用；cAMP-PKA 通路在真核細(xì)胞中比較保守，并能調(diào)節(jié)白念珠菌毒力，所以它們可能是抗真菌藥物開發(fā)的有希望靶點［12-14］。生物被膜中的菌絲對整個生物被膜結(jié)構(gòu)起著重要的穩(wěn)定性作用，是酵母細(xì)胞和其它菌絲支撐起來的框架。β-葡聚糖（β-glucan）的合成會影響白念珠菌生物被膜形成能力，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)生物被膜成熟以后，它頂層的菌絲細(xì)胞更具有掩蓋β-葡聚糖的能力，侵入性生長過程中穿透上皮細(xì)胞層，并通過物理刺穿吞噬細(xì)胞，避免免疫系統(tǒng)識別，引起免疫逃逸［10］。雖然菌絲細(xì)胞本身就有β-葡聚糖，但如果是未成熟的或是量不夠的菌絲細(xì)胞，就不能達到遮蓋引起逃逸的作用。因此，形成菌絲、菌絲與酵母粘附的能力對生物被膜的發(fā)育和維持至關(guān)重要，可以利用以上特性進一步破壞生物被膜形成的條件。

1.3 生物被膜與細(xì)胞外基質(zhì) 細(xì)胞外基質(zhì)的研究一直以來是了解白念珠菌耐藥的一個重要方向，但它基質(zhì)成分比較復(fù)雜。細(xì)胞外基質(zhì)由生物被膜內(nèi)細(xì)胞分泌的胞外聚合物組成，是糖蛋白（55%）、碳水化合物（25%）、脂質(zhì)（15%）和核酸（5%）構(gòu)成的復(fù)雜混合物質(zhì)，其中碳水化合物主要是α-甘露聚糖（α-Mannan）和β-1，6-葡聚糖多糖（β-1，6-glucan polysaccharide），其次是β-1，3-葡聚糖（β-1，3-glucan）［15］。生物被膜一般比浮游細(xì)胞要厚，并且抗耐藥性強。將生物被膜基質(zhì)視為白念珠菌生物被膜的一種胞外酶活性成分，一種既能分解分子來作為保護性反應(yīng)又能獲得營養(yǎng)來源的成分。細(xì)胞外基質(zhì)在生物被膜中處于保護白念珠菌生物被膜完整性不受損的角色，這是外來干預(yù)措施攻破生物被膜的關(guān)鍵一步。β-1，3-葡聚糖是白念珠菌細(xì)胞外基質(zhì)中的一種重要多糖，它利用自身的特殊性能在唑類藥物恢復(fù)力中起主要作用［16］，而β-1，3-葡聚糖酶具有抗生物被膜活性，它可以降解白念珠菌生物被膜的中β-1，3-葡聚糖，因此β-1，3-葡聚糖酶可能是一種有用的抗生物被膜劑［17，18］。

1.4 生物被膜群體效應(yīng) 群體效應(yīng)（Quorumsensing，QS）是一種微生物通訊機制，其信號分子的積累使細(xì)胞能夠感知細(xì)胞密度，是生物被膜形成的基礎(chǔ)。白念珠菌中發(fā)現(xiàn)的真菌群體效應(yīng)信號分子包括法尼醇（Farnesol））和酪醇（Tyrosol）［19，20］。法尼醇是白念珠菌中甾醇生物合成的前體，是目前研究最多的群體效應(yīng)信號分子，它能抑制白念珠菌從酵母向菌絲形式轉(zhuǎn)化，還能影響生物被膜細(xì)胞粘附、成熟發(fā)育以及內(nèi)部的結(jié)構(gòu)［21］。之前研究通過XTT 細(xì)胞活性測定法檢測法尼醇對生物被膜的作用，發(fā)現(xiàn)在37.5—600μm 濃度范圍內(nèi)，法尼醇對白念珠菌生物被膜具有濃度、時間及種類依賴性的抑制作用［22-24］。作用僅次于法尼醇的群體效應(yīng)信號分子是酪醇，它不僅促進菌管的形成，還促成白念珠菌從酵母形式向菌絲形式的轉(zhuǎn)化［25］，酪醇在生物被膜形成早期和中期階段的作用最顯著。如果利用酪醇和法尼醇的各自特性結(jié)合，可能針對抗白念珠菌的治療有一定幫助。因法尼醇是甾醇生物合成的前體，所以白念珠菌生物被膜中的法尼醇暴露后，會導(dǎo)致麥角甾醇（Ergosterol）生物合成基因的下調(diào)，因此法尼醇可通過影響麥角甾醇生物合成中的部分基因表達來抑制生物被膜介導(dǎo)的耐藥性［26］。在未來的研究中，可以嘗試用法尼醇作為減少白念珠菌生物被膜的替代劑。

2 生物被膜耐藥機制

白念珠菌耐藥因素很多，生物被膜耐藥是主要原因之一。白念珠菌生物被膜比浮游細(xì)胞更具抗性，對抗真菌藥物不敏感，從而產(chǎn)生臨床耐藥性。生物被膜耐藥性形成機制復(fù)雜，其中主要機制包括：藥物外排泵的表達增加、細(xì)胞外基質(zhì)保護作用及生物被膜中存在“持久性”細(xì)胞［10］。外排泵是存在細(xì)胞質(zhì)膜中的轉(zhuǎn)運蛋白，一般在生物被膜中就有表達，主要對唑類藥物分子進行排泄，當(dāng)使用氟康唑后，外排泵表達更明顯，不斷將藥物分子從細(xì)胞內(nèi)部輸送到細(xì)胞外，這樣就降低了作用部位的藥物濃度。持留細(xì)胞（Persister cells）是代謝活性降低的非分裂細(xì)胞，它們不僅對抗菌藥物具有高度耐藥性，也可能在藥物治療后播種新的生物被膜感染。生物被膜在成熟階段會釋放出大量的細(xì)胞外基質(zhì)，它就像一層保護膜，可以作為物理屏障阻擋抗真菌藥物的滲入，并保護和維持生物被膜的完整性。

3 抗白念珠菌生物被膜藥物研究進展

目前有4類藥物被廣泛用于抗真菌：唑類衍生物、多烯、棘白菌素和核苷類似物。氟康唑具有抗真菌譜廣、毒性低、生物利用度高等特點，被廣泛用于白念珠菌感染的臨床治療。麥角甾醇作為白念珠菌生物被膜的組成成分，是發(fā)揮毒力的重要結(jié)構(gòu)，使用氟康唑能抑制麥角甾醇合成。因為氟康唑是抑菌劑，且對于細(xì)胞膜的滲透性比較差，不僅影響藥物濃度，還易引起耐藥，所以現(xiàn)在非抗真菌藥物與抗真菌藥物的協(xié)同治療逐漸引起大家的關(guān)注，這里主要描述氟康唑耐藥時的協(xié)同治療。

布洛芬是常見的非甾體抗炎藥（NSAID），多用于緩解急性疼痛和發(fā)熱［27］。非甾體抗炎藥可以通過花生四烯酸途徑，減少前列腺素E2 的產(chǎn)生，限制致病真菌的毒力，并減少生物被膜形成［28］。研究發(fā)現(xiàn)，布洛芬能在體內(nèi)增強氟康唑的抗真菌活性并降低白念珠菌的毒力，破壞真菌生物被膜［29］。不僅如此，布洛芬還是生物被膜外排泵阻滯劑，能夠防止唑類藥物從細(xì)胞內(nèi)排出。布洛芬與唑類藥物的協(xié)同作用使抗真菌敏感性增加的原因可能是細(xì)胞內(nèi)真菌藥物濃度增加，逆轉(zhuǎn)了生物被膜的耐藥［30］。氯尼達明（Lonidamine，LND）是一種非常規(guī)的抗腫瘤藥物，可通過抑制糖酵解途徑干擾癌細(xì)胞的能量代謝。Chen等人［31］通過使用氯尼達明與氟康唑聯(lián)合作用對耐藥性浮游白念珠菌和預(yù)形成的生物被膜進行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)氯尼達明和氟康唑協(xié)同作用下對早期（4h 與8h內(nèi)）新形成的生物被膜有較強的抑制作用；當(dāng)12h 后，對生物被膜幾乎無協(xié)同作用。這就提示氯尼達明和氟康唑的協(xié)同作用可以對生物被膜的產(chǎn)生有一定的抑制作用，但這僅適用于早期未成熟的生物被膜，對晚期已成熟生物被膜作用有限或幾乎無作用。

4 結(jié)論與展望

白念珠菌的致病性主要取決于生物被膜，形成生物被膜的能力是一個極其復(fù)雜的過程，因此使白念珠菌相關(guān)感染的治療變得復(fù)雜。生物被膜形成、抗真菌藥物特性和多種微生物內(nèi)的相互作用一直是白念珠菌生物被膜持續(xù)研究的熱點，目前仍有許多機制等待著我們繼續(xù)探索。今后我們應(yīng)在注重真菌共生與感染之間平衡的同時，利用現(xiàn)有的知識去發(fā)現(xiàn)更多對抗白念珠菌感染的方法及研究生物被膜形成機制。