酶聯免疫吸附試驗在獸藥殘留檢測應用中的體會

□文/李漢中

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是當前應用廣泛的一項定性/半定量檢測抗體（抗原）的免疫酶檢測技術。其基本原理是利用抗原抗體的特異性結合，將待測物質（違禁物或獸藥小分子）作為抗原與其特異性抗體反應，再利用酶的高效催化性將此反應效果放大，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，存在一定的線性相關關系，故可根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析。目前，已廣泛應用于獸藥殘留檢測、生物毒素檢測、農藥殘留檢測、微生物檢測、轉基因產品檢測等多個領域。

ELISA 作為一種快速檢測方法由于其操作簡單，能得到定量檢測結果，廣泛應用于獸藥殘留檢測領域。與我們生活息息相關的肉、蛋、奶以及常見的水產品如魚，蝦中的違禁藥物，像大家熟知的“瘦肉精”“蘇丹紅”“三聚氰胺”“黃曲霉M1”以及常見的抗生素都有技術成熟的試劑盒。

本人從事獸藥殘留檢測多年，發現關于ELISA 的科學研究方面的文章比較多，本文著重討論多年來使用ELISA 檢測試劑盒進行獸藥殘留檢測的經驗和教訓，以期與各檢測單位一線工作者分享。

一、酶聯免疫吸附試驗的地位

酶聯免疫吸附試驗自20 世紀70 年代問世以來經過了近幾十年的快速發展，已廣泛應用于各個領域。雖然其有假陽性率高、反應過程對外界環境要求較高、反應時間較長（相對于膠體金快檢卡而言）等缺點，但由于其費用低廉、前處理簡單、儀器設備便于操作、結果定量化、安全性好、污染小，在今后相當長的一段時間內仍會在相關企業、基層檢測機構扮演重要角色。

二、影響酶聯免疫吸附試驗結果的幾個方面

（一）酶聯免疫檢測試劑盒的選擇

由于酶聯免疫吸附試驗的原理，因此不同企業生產的抗體的特異性，穩定性的好壞對整個試劑盒的檢測結果影響較大。結合本人多年以來的工作經驗而言，采購試劑盒時一定要慎重選擇其生產企業，要購買那些技術研發實力雄厚的企業的產品，建議可參考農業部備案的廠家目錄。因其技術水平相對較高，產品相對較穩定。十幾年前本人使用過一些不知名企業生產的試劑盒，在使用過程中出現了假陽性率過高，標準曲線不成線性等問題。

（二）酶標儀的選擇

酶聯免疫吸附試驗除了用到檢測試劑盒之外，在整個試驗過程中還有一個重要的儀器設備那就是酶標儀。其用來測量加完終止液后酶標孔中液體的吸光度。利用其中某種物質含量與其吸光度之間的函數關系，來反推待測物濃度，因此不同廠家、不同型號之間的質量也存在差異，在選購之前要認真考慮。

（三）酶聯免疫檢測試劑盒使用過程中需要注意的問題

1.樣品的前處理

一般來講酶聯免疫吸附試劑盒中待檢樣品的前處理需要經過樣品稱量、目標物提取等步驟。具體操作就是在稱量好的樣品中加入某種試劑，振蕩混勻，然后離心，離心后有的直接取上清液若干量，再加上復溶工作液若干量，混勻后即可用于檢測；有的上清液需要再50～60℃氮氣吹干后，加入一定量的正己烷，混勻一定時間，再加入一定量的復溶工作液，混勻、振蕩、離心后取下層水相直接用于檢測。本人認為在這些環節中，樣品的稱量很關鍵，首先要根據稱量準確選擇精確度符合要求的天平。其次振蕩、離心這兩個環節對試驗結果也有影響，要認真規范操作，不可隨意縮短振蕩時間。

2.點板過程

酶聯免疫吸附試驗最主要的試驗操作就是點板，即使用單道移液器或多道移液器向試劑盒的96孔板的U 型孔中添加各種試劑。因此能否正確使用此器具對試驗結果是否準確至關重要。怎么保證其正確使用呢？首先，如果條件允許，最好定期找有資質的機構對其進行檢定或校準，保證其自身質量沒問題。如果條件不允許可在使用前使用純水，電子天平，自檢一下使其風險可控。其次要會正確使用。其常規的使用方法為“吸一打二”。其中的“一二”指的是移液器控制按鈕下壓的兩個檔位，下壓遇到阻力時為第1 檔，繼續加大力度壓至按不動為第2 檔，所謂的“吸一打二”就是指吸取液體的時候，用拇指按住頂端的控制按鈕至第1 檔，而向外釋放液體的時候用拇指按住頂端的控制按鈕至按不動為止。后來又有人提出了“吸二打一”的使用方法。要注意的是實際操作時，如果將移液器調至一固定量程，需要反復多吸幾次，只有在第一次吸取時是“吸二打一”，此后再吸再打時均是“吸一打一”。在這里還有一點需要注意，就是“吸二打一”的量程不能超過移液器的最大量程。舉例說明，如果移液器的量程為20～200 微升，如果采用“吸二打一”的吸取方式，最好吸取量不要超過100微升。因此洗板時不能采用“吸二打一”。個人認為無論是“吸一打二”還是“吸二打一”只要操作規范都可以準確量取。切忌使用過程中吸打動作太快，這樣容易引起吸取液體時，因為有氣泡可能導致液體接觸到移液器的頭部，污染液體，或釋放液體時太快，液體濺到目標U 型孔外面，影響試驗結果。當吸取黏性較大，泡沫較多濃度較小的目標液時如酶標二抗工作液，抗體工作液、低濃度的標準品時可以考慮采用“吸二打一”的操作。當吸取黏性較小的目標液體時，如底物A、底物B、動物尿液樣本，可以采用“吸一打二”的操作。因為整個試驗過程不可避免的要使用八道移液器，在此著重說一下八道移液器使用的注意事項。八道移液器使用過程中首先要確定每一個槍頭都安裝到位，擰緊了，其次要保證使用過程中槍頭要垂直懸空于目標微孔之上，盡量不要接觸微孔壁，再次一定要注意使用過程中觀察八個槍頭中的液面高度是否一致，如若差別太大，則證明吸量不準確，就會影響試驗結果，尤其是量取酶標二抗和抗體工作液以及洗板時要注意。

3.其他可能影響試驗結果的方面

整個檢測試劑盒內的試劑，提前包被好抗原或抗體的96孔板，包括處理好的待檢樣品在點板之前一定要回復至室溫，實踐證明檢測過程中的環境溫度對結果影響較大，溫度不宜過低。所有試劑尤其是各個濃度的標準品、酶標二抗、抗體工作液、底物A、底物B 在使用前一定要混勻，混勻動作不可太粗暴，搖晃不可太劇烈，否則會產生大量氣泡，影響結果。

整個實驗過程一定要認真按照說明書的要求操作，不能靠記憶去操作。因為雖然原理一樣，但由于不同檢測項目用到的ELISA 有直接ELISA、間接ELISA、競爭ELISA 等區別，所以在點板過程中會存在一些差異，如酶標二抗和抗體工作液的添加順序，酶標二抗工作液的配制，底物A、底物B 的添加順序添加量，洗板次數，避光反應時間長短等。

三、實驗結果的計算

很多酶標儀都帶有自己的計算軟件，但是96孔板的布板模式相對來說比較死板不夠靈活，就是說標準品和樣品的位置相對固定，不可以根據每一次實驗的實際情況靈活布板。因此，建議用酶標儀只進行吸光度的檢測，得到吸光度后，再利用專業的計算軟件去計算。

以上就是我作為一個長期使用酶聯免疫檢測試劑盒進行獸藥殘留檢測工作的一些經驗、教訓和體會，以便給使用試劑盒的工作人員提供參考，使大家少走彎路，得到準確的實驗結果。