基于紅外光譜技術的蜂蜜理化性質快速檢測

張廣琪 ，甘芝霖 ※，楊 陽 ，高瑋蔓

（1.北京林業大學 生物科學與技術學院，北京，100083；2.林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京，100083；3.北京便利蜂連鎖商業有限公司，北京，100089）

0 引 言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結合后，經充分釀造而成的天然甜味物質[1]，深受大眾喜愛[2]。蜂蜜中的糖類（占75%左右，其中果糖和葡萄糖含量在65%以上）、溶菌酶等物質賦予蜂蜜較好的抗菌活性[3-4]；多種抗氧化因子使其具有較好的抗氧化性，是一種潛在的天然抗氧化劑[5]；氨基酸、維生素、礦物質、酶、酚類等豐富物質，使其具有抗炎、免疫調節、調節血糖、調節腸道微生物等多種功能活性[6-8]。

蜂蜜中各成分的含量和種類會因花蜜的種類和地理位置不同產生差異[9]，根據產品功效而選擇某中成分含量較高的蜂蜜品種，不但能節約生產成本，也能極好的保證產品的功能性[10-12]。因此，研究蜂蜜中各理化指標間的相關性和各成分快速定量檢測，對蜂蜜的實際生產和蜂蜜產業的發展具有重要意義。

蜂蜜理化性質定量分析通用的國際標準檢測技術包括化學法、分光光度法、GC[13]，可以準確得到蜂蜜各組分的含量，但步驟繁瑣、耗時耗力且成本較高，難以及時、原位、快速、全面的滿足蜂蜜中主要成分的含量快速測定。

紅外光譜技術是一種快速、綠色環保的分析技術，根據頻率范圍的不同，又可分為近紅外光譜技術（nearinfrared spectrum，NIR）和中紅外光譜技術（midinfrared spectrum，MIR）[14]。國內、外利用近紅外光譜技術分析蜂蜜中組分含量的基礎性研究較多，LI等[15]利用近紅紅外技術對蜂蜜的水分含量建立PLS定量分析模型，模型準確性較好。APRICENO等[16]研究表明近紅外光譜-化學計量方法可用于蜂蜜中5-羥甲基糠醛（HMF）的快速定量分析。丁家欣等[17]采用近紅外光譜建立了蜂蜜中的葡萄糖和果糖定量分析模型。MIR定量蜂蜜物質的相關研究較少，LI等[18]將CNN與 MIR相結合并用于蜂蜜的快速摻假鑒別。?ZBAY等[19]將MIR方法與化學計量學相結合，研究表明MIR可用于估計糖漿摻假量的水平。關于MIR在蜂蜜檢測中的應用研究有待進一步拓展。在現有研究中，對NIR和MIR的定量能力進行比較并將二者融合應用于定量分析的研究較少，對此本文開展了相關研究。

本研究以蜂蜜為對象，采用國際通用檢測方法對蜂蜜各理化指標進行測定，并用主成分分析（principal component analysis，PCA）[20]考察指標間的相關性，采用紅外光譜技術結合偏最小二乘回歸（partial least square regression，PLSR）分析方法[21]，建立蜂蜜中理化性質的PLS定量分析模型，將NIR和MIR進行比較和融合，探究模型對蜂蜜組分的定量能力，考察融合近、中紅外光譜信息對蜂蜜理化指標定量精度的提升效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蜂蜜（共116個樣品，其中荊花蜜39個，棗花蜜27個，洋槐蜜37個，油菜蜜13個）由北京百花蜂業科技發展股份公司采集；糖標準品，Sigma-Aldrich中國公司；碘，天津市大茂化學試劑廠；乙酸鈉，北京化學試劑公司；可溶性淀粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；冰乙酸，北京化工廠；氯化鈉、甲酸、異丙酮、茚三酮、乙二醇甲醚、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、碘化鉀，分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司；5-羥甲基糠醛（純度99%），Sigma公司；甲醇、乙腈，色譜純，西隴化工股份有限公司；脯氨酸標準品，純度≥99%，Sigma-Aldrich中國公司；實驗室自制超純水。

1.2 儀器和設備

傅里葉變換近紅外光譜儀，德國布魯克公司；傅里葉變換紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司；色譜柱YMC-Pack Polyamine Ⅱ；Venusil XBP-C18色譜柱，博納艾杰爾科技有限公司；WAY-2S型數字阿貝折光儀，上海精密科學儀器有限公司；HX-1 050恒溫循環器，北京德天佑科技發展有限公司；842型自動電位滴定儀，瑞士萬通公司；pH計，PB-10，Sartorius；Orion 5-Star臺式多參數測量儀；流變儀，美國TA公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；恒溫水浴鍋，北京長安科學儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀，配有LC-20AT洗脫泵、SPD-20A檢測器、CTO-20A柱溫箱 LC Solution工作站，島津國際貿易有限公司；水系濾膜，0.45 μm，博納艾杰爾科技有限公司；恒溫水浴鍋，北京長安科學儀器廠；Hunterlab Colorquest XE臺式分光測色儀，美國 Hunter Lab公司；電子分析天平，感量0.001 g，Sartorius，BS223S。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集及前處理

采集樣品種類包括荊花蜜、棗花蜜、洋槐蜜和油菜蜜。采集由北京百花蜂業科技發展股份公司完成，每個養蜂廠選取1～2個蜂群，每個樣品采集1 kg，采集的樣品直接裝瓶。采集樣品于實驗室進行過濾處理。

1.3.2 蜂蜜理化性質分析

共檢測了4種蜂蜜116個蜂蜜樣品的上述指標，所采用的檢測方法為國際標準中的通用方法和通用儀器[22-24]，結合試驗過程中的問題，對部分方法進行了改進。

葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖：參照《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測定方法—液相色譜示差折光檢測法》[25]，進行了適當修改。

色譜柱溫度，25 °C；進樣量，20 μL；分析時間，25 min；體積流量，1 mL/min。

水分：采用折光法，參照國際蜂蜜委員會的方法[24]和中國進出口蜂蜜檢驗方法[26]；酸度：參照IHC的方法[24]和國標中的方法[26]；電導率：參照GB/T 18 932.15-2003中的方法[27]，使用實驗室自制超純水稀釋蜂蜜，電阻率18.2 MΩ·cm。淀粉酶值：參照了國標[28]方法；5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）：參照GB/T 18 932.18-2003[29]；脯氨酸：采用分光光度法，參照標準SN/T 0850-2000[30]；

pH值: 稱量(20±0.001) g蜂蜜樣品，用超純水溶解并稀釋，定容至100 mL容量瓶，用pH計測定；黏度：用流變儀測定；色差用Hunterlab Colorquest XE臺式分光測色儀測定。

數據處理：計算全部樣品和不同品種蜂蜜的平均值和標準偏差，對平均值進行了方差分析。對全部理化指標數據結果進行了主成分分析，考察指標間的相關性。數據分析和繪圖軟件使用OriginPro 8.6和Excel 2017等。

1.3.3 紅外光譜檢測及PLSR定量模型的建立

1）光譜采集

近紅外光譜：為消除樣品溫度的影響，檢測樣品提前一天與儀器放于同一環境下，環境溫度為室溫25～26 °C。測量樣品前進行儀器的自檢，并記錄空氣背景，測樣過程中每隔1 h掃描背景一次，軟件自動扣除背景。采用MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，儀器的光學配置：NIR液體光纖探頭，分束器Quartz，檢測器TE-InGaA。光譜采集選用透射模式，光譜掃描波數范圍為10 000～4 000 cm-1，以空氣為參比，光程為2 mm，分辨率為8 cm-1，掃描速度10 kHz，背景掃描64次，樣品掃描64次。

中紅外光譜：將檢測樣品提前一天與儀器放于同一環境下，環境溫度為室溫23～25 °C。測量過程中使用無水乙醇對樣品進行擦洗，考慮到乙醇揮發可能對樣品盤溫度的影響，每次添加樣品后，穩定30 s再進行光譜測量。采用傅里葉變換紅外光譜儀，儀器的光學配置：銦鎵砷（InGaAs）檢測器；Crystals Diamond/ZnSe；ATR附件；光譜掃描范圍4 000～500 cm-1，采集吸光度，掃描次數4，分辨率4 cm-1；以空氣為參比，并記錄空氣背景，測樣過程中每隔0.5 h掃描背景一次，軟件自動扣除背景。

2）近、中紅外光譜技術比較和融合

比較近、中紅外光譜技術對蜂蜜組分的定量能力。針對脯氨酸和淀粉酶含量，繪制紅外光譜平局融合譜圖，考察是否能通過融合近、中紅外光譜信息，提升對這兩個指標的定量精度。因融合光譜的數據繁多，采用遺傳算法（genetic algorithms, GA）[31]進行變量篩選，從大量的原始光譜數據中，提取出有效的變量；采用融合光譜對淀粉酶值和脯氨酸均進行了遺傳偏最小二乘回歸（genetic algorithms partial least squares regression，GAPLS），直接在Matlab中調用，最大進化代數設置為100，以累計貢獻率（CV）和交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）為指標確定要選擇的變量個數。

3）數據處理

先對光譜數據進行預處理、異常樣品的剔除。預處理的方法包括：平滑、標準歸一化、多元散射校正、導數處理、中心化，一種或多種方法結合。通過杠桿值和學生化殘差值，剔除光譜異常值和化學值異常值。以全光譜建立各指標的偏最小二乘回歸（PLSR）定量模型，其中，以RMSECV和RMSEC為參考選取主成分個數。數據分析采用Matlab 7.8.0軟件，利用OriginPro 8.6等軟件進行圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜理化性質數據

對采集的蜂蜜樣品的各項指標進行常規方法檢測，得到全部蜂蜜樣品中各組分的含量數據，計算全部樣品和不同品種蜂蜜的平均值和標準偏差，并對平均值進行了方差分析，詳見表1。所得數據可用于輔助判斷所建立的PLSR定量模型的精確性。

表1 全部蜂蜜樣品的物理化學指標檢測結果描述Table 1 Physical and chemical indicators description of all the honey samples

樣本糖含量特征與文獻報道和國內外蜂蜜標準描述相符[13,16]。比較文獻結果發現，本試驗采集的蜂蜜樣品糖含量指標正常，果糖和葡萄糖含量率高于文獻結果，蔗糖和麥芽糖含量相近，且稍低于文獻結果。與文獻中的結果相比，電導率指標正常（小于800 μS/cm）；pH值范圍正常（4左右）；水分含量偏高，文獻數據在17～18%左右，國標中規定蜂蜜一級品≤20、二級品≤24，本試驗樣本總體偏高（21.94），且4個蜜種中油菜蜜水分含量達到28，這主要是與本試驗采集的是原料蜂蜜有關，其次采蜜時期北方地區降雨頻繁；全部樣品淀粉酶值平均值為15.324 mL /(g·h)，高于GB14963-2011中的規定和文獻中的數值，表明本試驗采集的蜂蜜樣品較新鮮。HMF是美拉德反應和焦糖化反應的指示產物，形成于蜂蜜的儲藏過程中，允許存在，但應當50 mg/kg[13,32]。HMF的含量結果說明本試驗采集的蜂蜜品質較高，新鮮度好。脯氨酸可以反映出蜂蜜整體的氨基酸含量，并與蜂蜜的抗氧化性能有關[33]。

2.2 主成分分析結果

對全部理化指標數據結果進行主成分分析。通過對數據進行降維，提取較少的主成分，全面考察蜂蜜各指標間是否相互影響，具有相關性。表2為全部理化指標結果的相關系數矩陣，相關系數為1，表示完全正相關，為-1，表示完全負相關，為0表示完全不相關。表中可以看出，色差結果、電導率和pH值，三者之間，兩兩相關性較高，有研究人員指出了礦物質含量高的蜂蜜顏色較深，其電導率值也會偏高[34]。

表2 理化指標間的相關系數矩陣Table 2 Correlation matrixes of physical and chemical indicators

pH值和可滴定酸呈現明顯的負相關，pH值越低，可滴定酸度越高。水分含量與黏度呈明顯負相關，水分含量越少，蜂蜜黏度越高。

2.3 蜂蜜原始光譜圖

2.3.1 近紅外光譜圖

記錄樣品吸光度圖譜，得到的全部蜂蜜樣品近紅外譜。由圖1可知，不同蜂蜜樣品，因品種、顏色等不同，NIR圖存在差異，曲線趨勢整體一致。

圖1 蜂蜜近紅外透射光譜Fig.1 Transmittance NIR spectra of honey

2.3.2 中紅外光譜圖

全部樣品的中紅外光平均值譜圖見圖2。觀察圖2，MIR光譜圖中的吸收峰個數較NIR多，2 000 cm-1附近出現了明顯的噪聲信息，光譜信息集中在1 600～750 、1 450～800 cm-1光譜區間主要反映了果糖、葡萄糖和蔗糖的光譜吸收，其中900～750 cm-1為糖的特異吸收區間。1 153～904 cm-1附近的吸收為C-O和 C-C的伸縮振動，1 474～1 199 cm-1附近的吸收來自于O-C-H、C-CH和 C-O-H的彎曲振動，2 934 cm-1附近的吸收峰被認為與氨基酸的吸收有關[35]。

圖2 蜂蜜傅里葉變換中紅外光譜ATR圖譜Fig.2 FT-ATR-MIR spectra of honeys

2.4 紅外光譜定量檢測

2.4.1 近紅外光譜PLSR模型

建立了17個指標的PLSR模型，模型的優化過程沒有展示，表3為本試驗得到的PLSR優化模型結果。各理化指標的模型預測值(NIR)和真實測量值散點圖如圖3、4所示。

圖3 果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、還原糖、果糖/葡萄糖、水分PLSR模型預測值(NIR)和真實測量值散點圖Fig.3 Scatter plot of fructose, glucose, sucrose, maltose, reducing sugars, fructose/glucose and water content between measured and predicted (NIR) values by PLSR models

圖4 HMF、脯氨酸、pH值、可滴定酸、電導率、淀粉酶值、色差、黏度的PLSR模型預測值（NIR）和真實測量值散點圖Fig.4 Scatter plot of HMF, proline, pH value, titration acidity, electrical conductivity, color and viscosity between measured and predicted(NIR) values by PLSR models

表3 蜂蜜理化指標近紅外光譜檢測的偏最小二乘回歸結果Table 3 PLSR model results for physical and chemical indicators determined by FT-NIR

由表3數據和散點圖，建模集和預測集相關系數均大于0.9的指標為：果糖（RMSEP=1.123 g/100 g）、果糖/葡萄糖（RMSEP=0.043 g/100 g）、水分（RMSEP=0.497 %）、黏度（RMSEP=0.662 Pa·s）、pH值（RMSEP=0.321）、色差的L*（RMSEP=0.471）和a*（RMSEP=0.150），說明這些指標的模型精度和穩健性都較高。

電導率的相關系數很好，但模型的RMSEP為49.27 μS/cm，相較驗證集的均值（268）數值較大，推斷主要原因為數據值大小分布不均勻。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖模型的相關性在0.6～0.85之間，RMSEP分別為1.559、0.126、3.742 g/100 g，綜合考慮3個指標的均值、相關系數和RMSEP，認為PLS模型對這3個指標的預測結果可以接受，但模型精度稍差。

脯氨酸、淀粉酶值和HMF的模型相關系數和RMSEP結果顯示，模型精度較差，預測結果可信度不夠。

觀察表3、1，比對蜂蜜各理化指標的測定數值的差值，該模型對果糖、葡萄糖、還原糖、果糖/葡萄糖、水分、黏度、pH值和色差具有良好的定量分析能力。對電導率、蔗糖、麥芽糖、可滴定酸，該模型的尚可以接受，模型精度能夠用于快速定量分析。對淀粉酶值、脯氨酸和HMF，模型定量精度均不夠。

2.4.2 中紅外光譜PLSR模型

表4為本研究得到的理化值FTMIR-ATR檢測的PLSR優化模型結果，圖5、6為各項理化指標模型預測值(FTMIR-ATR)和真實測量值散點圖。模型結果與NIR結果大體一致，對果糖、蔗糖、水分、電導率、黏度等結果理想，對脯氨酸、淀粉酶值和HMF的定量精度不夠。

圖5 果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、還原糖、果糖/葡萄糖、水分PLSR模型預測值(FTMIR-ATR)和真實測量值散點圖Fig.5 Scatter plot of fructose, glucose, sucrose, maltose, reducing sugars, fructose/glucose and water content between measured and predicted (FTMIR-ATR) values by PLSR models

圖6 羥甲基糠醛、脯氨酸、pH值、可滴定酸、電導率、淀粉酶值、色差、黏度的PLSR模型預測值（FTMIR-ATR）和真實測量值散點圖Fig.6 Scatter plot of HMF, proline, pH, titration acidity, electrical conductivity, color and viscosity between measured and predicted(FTMIR-ATR) values by PLSR models

表4 蜂蜜理化指標中紅外光譜檢測的偏最小二乘回歸結果Table 4 PLSR model results for physical and chemical indicators determined by FTMIR-ATR

2.4.3 近、中紅外光譜技術融合

對比單獨使用NIR和MIR對脯氨酸、淀粉酶值的最優PLS定量模型的結果（見2.4.1和2.4.2）：近紅外對脯氨酸的定量（rc0.614，rp0.530，RMSEC 53.87 mg/kg，RMSEP 54.95 mg/kg）；中紅外淀粉酶值（rc0.867，rp0.641，RMSEC 1.94 mL/(g·h)，RMSEP 3.03 mL/(g·h)）。經融合后脯氨酸的定量略有提高（rc，rp0.664，RMSEC 38.68 mg/kg，RMSEP 49.57 mg/kg），而對淀粉酶值的定量精度沒有提高（rc0.799，rp0.695，RMSEC 2.57 mL/(g·h)，RMSEP 3.02 mL/(g·h)）。可能有以下2種可能：1）淀粉酶值、脯氨酸等物質含量太少，糖和水的光譜吸收掩蓋了其反映出的信息，可能這種定量效果已經是接近極限了。2）融合光譜不能進行更多的數據預處理，比如導數，所以一方面光譜融合增加了信息量，同時不能進行有效的數據預處理也損失了有效信息。

表5 脯氨酸、淀粉酶值GAPLS定量分析結果Table 5 Results of GAPLS models predicting proline and diastase value

3 討 論

1）對近、中紅外在蜂蜜理化性質的定量檢測方面的能力進行比較。NIR預測精度更高的指標為：果糖（R2=0.908，RMSEP為1.123 g/100 g），蔗糖（R2=0.906，RMSEP為0.126 g/100 g），水分（R2=0.975，RMSEP為0.497%），電導率（R2=0.935，RMSEP為49.27 μS/cm），黏度（R2=0.949，RMSEP為0.662 Pa·s），pH值（R2=0.947，RMSEP為0.321）。MIR預測精度更高的指標為：葡萄糖（R2=0.813，RMSEP為1.185 g/100 g），麥芽糖（R2=0.798，RMSEP為0.204 g/100 g），還原糖（R2=0.711，RMSEP為3.106 g/100 g），果糖/葡萄糖（R2=0.942，RMSEP為0.043），可滴定酸（R2=0.890，RMSEP為2.333 mg/100 g）、淀粉酶值（R2=0.641，RMSEP為3.033 mL/＞(g·h)）和色差值（L*，a*，b*）。從總體來看，二者對脯氨酸、淀粉酶值的定量精度均不夠，這與文獻中報道的結果一致，普遍認為含量過低是主要原因。

比較二者使用的設備，NIR光譜采集使用的是液體光纖探頭，MIR光譜采集使用的是ATR附件，ATR附件體積大、昂貴，受限于實驗室使用。

2）對近、中紅外信息進行融合，融合后的光譜數據只提高了脯氨酸的定量精度，并沒有優化淀粉酶值的定量結果。目前，在數據融合過程中，還有很多需要解決的問題，比如明確什么類型的數據能夠進行融合、融合數據時使用的算法、對融合數據進行處理的方法等。

4 結 論

本研究以原料蜂蜜（棗花蜜、荊花蜜、洋槐蜜和油菜蜜）為對象，對蜂蜜指標間相關性進行分析，采用紅外光譜（NIR、MIR）結合化學計量學研究蜂蜜綜合理化性質（定量），建立理化性質定量檢測的PLS模型，以相關系數（R2）、RMSEC、國標法檢測數據等參數考察模型的穩健性和準確性，系統比較NIR、MIR定量能力，并考察技術融合的可行性。得到以下結論：

1）蜂蜜各指標具相關性，色差、電導率和pH值，三者之間兩兩正相關，pH值和可滴定酸，水分含量與黏度之間彼此呈負相關。

2）所建立模型對果糖、葡萄糖、還原糖、果糖/葡萄糖、水分、黏度、pH和色差數具有良好的定量分析能力（R2＞0.9）。對電導率（R2=0.935）、蔗糖（R2=0.906）、麥芽糖（R2=0.798）、可滴定酸（R2=0.890），本研究建立模型的R2＞0.7可以接受，模型精度能夠用于快速定量分析，對脯氨酸、淀粉酶值和HMF的定量精度均較低（R2＜0.7）。

針對不同的理化指標，NIR和MIR的定量能力各有所長；從儀器、附件和光譜采集模式角度上看，近紅外光譜技術的光纖探頭檢測實際應用前景更好。