葉酸中殘留溶劑三氯丙酮氣相色譜檢測方法

王莉莉，王曉鳳，李煥君，張曉燦，馬鳳霞，康 倩，王 麗，劉曉蓮，馬寧寧

（河北冀衡藥業(yè)股份有限公司，河北 衡水 053000）

0 引 言

葉酸（Folic acid） 又名維生素B9，是一種水溶性的維生素。葉酸在腸道吸收后，經(jīng)門靜脈進入肝臟，在肝內(nèi)二氫葉酸還原酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘乃臍淙~酸，四氫葉酸是體內(nèi)轉(zhuǎn)移“一碳基團”的載體，是DNA 合成的主要元素。

在臨床上，孕婦服用葉酸可預(yù)防胎兒唇腭裂，神經(jīng)管畸形等病變。另外，維生素C 與葉酸同服，可抑制葉酸在胃腸中吸收，大量的維生素C 會加速葉酸的排出。

目前，國內(nèi)上市有葉酸原料、葉酸片、注射用葉酸以及葉酸復(fù)方制劑。葉酸合成工藝一般都是以N- 對氨基苯甲酰-L 谷氨酸、2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽、三氯丙酮為基礎(chǔ)原料，經(jīng)反應(yīng)制得葉酸粗品，經(jīng)酸溶、堿溶、精制等純化得葉酸原料藥。

葉酸制備工藝相對成熟，在生產(chǎn)過程中以三氯丙酮作為原料，可能會殘留在成品葉酸中。各國藥典均沒有關(guān)于葉酸殘留溶劑三氯丙酮的檢測方法。按照國際制藥指南ICHQ3C，三氯丙酮屬于對人體有害的有機溶劑，所以，控制殘留溶劑非常必要。

本研究采用氣相色譜法，建立了葉酸原料藥中三氯丙酮殘留溶劑的測定方法及方法學(xué)研究，主要包括方法專屬性、溶液線性范圍、方法定量限及檢測限、方法精確度、溶液穩(wěn)定性、耐用性等方面的探討，旨在為葉酸中殘留溶劑的分析檢測及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

本研究開發(fā)了葉酸殘留溶劑三氯丙酮的定量檢測方法，為葉酸的生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)，同時也達到了提高葉酸質(zhì)量的目的。

1 實驗部分

1.1 實驗用分析儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

（1） 分析天平：QUINIX124-1CN 型，賽多利斯。

（2） 氣相色譜儀：Clarus 580 型，PE 氣相色譜儀。

（3） 超純水儀：Milli-Q IQ 7000 型，德國默克密理博。

（4） 數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

（5） 高純度氮氣發(fā)生器：SPN-300 型，北京中惠普分析技術(shù)研究所。

（6） 高純度氫氣發(fā)生器：SPH-300 型，北京中惠普分析技術(shù)研究所。

（7） 全自動空氣源：SPB-3 型，北京中惠普分析技術(shù)研究所。

1.1.2 主要試劑

（1） 氫氧化鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

（2） 三氯丙酮：中國食品藥品檢驗研究院。

（3） 葉酸：河北冀衡藥業(yè)股份有限公司。

1.2 色譜條件

（1） 檢測器：FID 檢測器。

（2） 檢測器溫度：250 ℃。

（3） 進樣口溫度：200 ℃。（4） 色譜柱溫度：150 ℃

（5） 毛細(xì)管色譜柱：ov-1(相當(dāng)于HPI 柱)，30 m×0.53 mm×3.0 um。

（6） 載氣：氮氣。

（7） 載氣流速：1 mL/min。

（8） 分流比：1∶1。

（9） 進樣量：1 μL，自動進樣。

（10） 量程：1。

1.3 溶液配置

1.3.1 對照溶液的配置

（1） 精密稱取0.5 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，測定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氫氧化鈉溶液，稀釋至刻度，作為三氯丙酮儲備液。

（2） 精密量取1.0 mL 儲備液于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氫氧化鈉溶液，稀釋至刻度，搖勻，作為三氯丙酮對照溶液。

1.3.2 供試品溶液的配置

（1） 精密稱取0.2 g 葉酸樣品于10 mL 容量瓶中。

（2） 再加入0.1%氫氧化鈉溶液，稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.4 計算方法

分別吸取1 μL 對照品溶液和供試品溶液分別注入至氣相色譜儀中，對照品溶液進5 針，供試品溶液進平行樣各進一針，按外標(biāo)法計算三氯丙酮的含量。

計算公式如下：

式中：As 為供試液圖譜中三氯丙酮的峰面積，mAu；Ar 為標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜中三氯丙酮的峰面積，mAu；Ws 為稱取樣品的質(zhì)量，g；Wr 為配制標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取三氯丙酮的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測方法的專屬性

（1） 精密稱取0.5 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，測定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氫氧化鈉溶液，稀釋至刻度，作為三氯丙酮儲備液。

（2） 精密量取1.0 mL 儲備液于100 mL 容量瓶中，加入0.1%氫氧化鈉溶液至刻度，搖勻，作為三氯丙酮對照溶液。

（4） 精密吸取1 mL 0.1%氫氧化鈉溶液于樣品瓶中，密封，作為空白溶液。

（5） 將分別量取的1 μL 對照溶液和空白溶液注入到氣相色譜儀中。

從空白溶液色譜圖中，未檢測到三氯丙酮，檢測結(jié)果表明無其他色譜雜峰，對葉酸殘留溶劑三氯丙酮含量的測定無明顯干擾，證明該方法專屬性良好。

2.2 檢測方法的線性關(guān)系

（1） 精密稱取0.5 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，測定值：80%） 加入至100mL 容量瓶中，再加入0.1%氫氧化鈉，稀釋至刻度，作為三氯丙酮儲備液。

（2） 精密量取1.0 mL 儲備液于100 mL 容量瓶中，加入0.1%氫氧化鈉至刻度，搖勻，作為三氯丙酮對照溶液。

（3） 自三氯丙酮的定量限至限度的150%，分別稀釋成濃度為10、30、50、70、90、110 ug/mL 6 個三氯丙酮的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并依次編號。

（4） 取上述各濃度的溶液1 μL，按照1.2 色譜條件，注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖并計算峰面積。

（5） 將得出的數(shù)據(jù)以峰面積為縱坐標(biāo)，以三氯丙酮溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

不同濃度的三氯丙酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積見表1。

表1 不同濃度的三氯丙酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積Table 1 Peak area of standard solutions of trichloroacetone at different concentrations

三氯丙酮溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 三氯丙酮溶液線性關(guān)系Fig.1 Linear relationship of trichloroacetone solution

由圖1 可以看出，在0.148 8～111.600 0 ug/ml濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，線性方程為y=8 058.5x+5 790.6。

2.3 方法的定量限和檢測限

取對照品溶液逐級稀釋，測定，以信噪比約為10 作為定量限，以信噪比約為3 作為檢測限，計算得出三氯丙酮的定量限為0.02 ug/ml，檢測限為0.079 ug/ml。

2.4 對照溶液的精密度實驗

（1） 精密稱取0.5g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，測定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氫氧化鈉，并稀至刻度作為三氯丙酮儲備液。

（2） 精密量取1.0 mL 儲備液于100 mL 容量瓶，再加入0.1%氫氧化鈉至刻度，搖勻，配制成三氯丙酮標(biāo)準(zhǔn)品50 ug/mL 的溶液。

（3） 取上述溶液1 μL，按照1.2 色譜條件，注入氣相色譜儀中，連續(xù)進樣6 針。

三氯丙酮對照溶液的精密度實驗結(jié)果見表2。

表2 三氯丙酮對照溶液精密度實驗結(jié)果Table 2 Precision experimental results of trichloroacetone control solution

由表2 可以看出，檢測結(jié)果的重復(fù)性良好，各峰面積RSD＜5.0%，符合分析方法學(xué)的要求。

2.5 考察對照溶液的穩(wěn)定性

（1） 精密稱取0.500 0 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，測定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氫氧化鈉，稀釋至刻度，作為三氯丙酮儲備液。

（2） 精密量取1.0 mL 儲備液于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氫氧化鈉至刻度，搖勻，配制成三氯丙酮標(biāo)準(zhǔn)品50 ug/mL 的溶液。

（3） 分別于0、2、4、8、12、18、24 h 取上述溶液各1 μl，按照1.2 色譜條件，注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖。

三氯丙酮對照溶液的穩(wěn)定性結(jié)果見表3。

表3 三氯丙酮對照溶液的穩(wěn)定性結(jié)果Table 3 Stability results of trichloroacetone control solution

由表3 可以看出，與0 h 相比，24 h 對照品溶液穩(wěn)定，峰面積RSD＜5%，符合方法學(xué)的要求。

2.6 對照溶液耐用性考察

精密量取三氯丙酮對照品溶液1 uL，設(shè)置不同的流速為0.8、1.0、1.2 mL/min、進樣口溫度分別為198、200、202 ℃，檢測器溫度分別為248、250、252 ℃，測定各條件下系統(tǒng)的耐用性。

三氯丙酮的耐用性實驗結(jié)果見表4。

表4 三氯丙酮的耐用性實驗結(jié)果Table 4 Durability test results of trichloroacetone

2.7 葉酸樣品的測定

按照1.3 溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)，取3 批葉酸原料藥分別進行有關(guān)殘留溶劑三氯丙酮的檢測，葉酸樣品中殘留溶劑的實驗結(jié)果見表5。

表5 葉酸樣品中殘留溶劑的含量Table 5 Content of residual solvents in folic acid samples

由表5 可以看出，葉酸原料藥中無三氯丙酮殘留。

3 結(jié) 語

建立的定量分析葉酸中的殘留溶劑三氯丙酮的氣相色譜法，具有操作簡單、耗時短、誤差小等優(yōu)點。使用0.1%氫氧化鈉作溶劑，檢驗葉酸中殘留溶劑三氯丙酮，結(jié)果表明，三氯丙酮濃度在0.148 8～111.600 0 ug/mL 之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5%。通過方法學(xué)驗證，該方法精密、準(zhǔn)確、檢測性良好。因此，氣相色譜法可以準(zhǔn)確測量葉酸原料藥中殘留溶劑三氯丙酮的含量。