食品中常見病原微生物的檢驗

張姣

食品安全問題是重要的社會健康問題。食品安全性、食品營養性和食品感官要求是食品質量的基本要素。“民以食為天，食以安為先”突出了食品安全的重要性。食品質量安全的檢驗需要從實際出發，運用嚴謹、科學、有效的方法。尤其是食品微生物檢驗，需從食品生產的工藝環節入手，聯系“人、機、料、法、環”五要素，從生產人員、生產設備、原輔料、包裝材料、制備方法、生產儲存環境多方面入手，完成食品微生物檢驗指標：菌落總數、大腸菌群、病原微生物（致病菌）、霉菌及其毒素。其中病原微生物檢驗是食品微生物檢驗的重要內容。本文將從質量安全入手，闡述如何從技術層面確保食品受病原微生物污染情況在可控范圍內，從而確保食品質量安全。

現代食品必須具備三個基本要求，即“安全性”、“營養性”和“感官要求”。“民以食為天，食以安為先”突出了食品安全的重要性。因此，對食品進行微生物學檢驗尤其重要，成為食品檢測必不可少的重要組成部分。食品微生物學檢驗的指標包括：菌落總數、大腸菌群、病原微生物（致病菌）、霉菌及其毒素，其中病原微生物檢驗是食品微生物檢驗的重要內容。其中部分病原性微生物可通過食品被污染或通過細菌的代謝產物-大量毒素，引起的食物中毒，該種中毒常以急性過程為主要特征，稱為細菌性食物中毒，在食物中毒原因中，排列第一。以動物為食品原料的食品最常見，具有季節性明顯，以夏秋季發病率最高，病死率因中毒病原而異，常見為腸道致病菌等特點。本文將針對食品中常見病原微生物，從生物學概述、檢驗方法、結果與報告幾方面對其進行探討。

1.沙門菌檢驗

1.1生物學概述

沙門菌屬是寄生于恒溫動物腸道，一大群生化反應相似的革蘭陰性桿菌。需氧、無芽孢、有鞭毛，有運動能力，能有規律地發酵葡萄糖并產酸產氣。

沙門菌屬種類繁多，少數只對人致病。可導致人類疾病有傷寒、副傷寒、集體或單發性食物中毒。在細菌引起食物中毒案例中，由沙門菌導致的食物中毒常是第一或第二原因。

食品中沙門菌的定性檢驗方法有五個步驟：前增菌（非選擇性增菌）→選擇性增菌→平板分離→生化試驗鑒定到屬→血清學分型鑒定。

目前食品中的沙門菌檢查方法為GB4789.4-2016，報告25g/mL食品中是否檢出沙門菌。

1.2檢驗方法

1.2.1前增菌

稱取25g（mL）樣品放入盛有225 mLBPW中，注意不能均勻分布于稀釋液的樣品需用無菌均質杯/均質袋或勻漿儀，以8000-10000轉/分的速度，均質1-2分鐘，即保證樣品中微生物均勻分布于BPW中。若樣品為液態，則振蕩混勻即可。于36±1℃培養8-18小時。

如為冷凍產品，需提前解凍。條件為45℃以下，不超過15分鐘。

1.2.2選擇性增菌

經過前增菌，食品中微生物均大量繁殖，包括除沙門菌和其他種類微生物均迅速繁殖。但沙門菌往往是食品所含細菌中的一小類，沙門菌外大量其他菌群甚至會干擾沙門菌的檢出。故為了排除非沙門菌菌群干擾，需要對前增菌的培養液做選擇性增菌。方法為：輕輕搖動前增菌的培養液，無菌吸管取1mL，轉種有10mLTTB的無菌試管內，于（42±1）℃培養18-24小時。同時，另取1mL，轉種于有10mLSC的無菌試管內，于（36±1） ℃培養18-24小時。TTB和SC均為選擇性增菌液，只適合沙門菌生長繁殖。

1.2.3選擇性平板分離

經過選擇性增菌，如TTB和SC培養液由澄清變為渾濁，則說明培養液中大概率有沙門菌生長繁殖。此時分別用接種環移取渾濁的SC增菌液和TTB增菌液，分別劃線接種于下列選擇性平板： BS、XLD、HE、沙門菌屬顯色培養基平板。其中，BS為必選平板，XLD、HE、沙門菌屬顯色培養基平板可任選其一。四種平板培養基均為沙門菌鑒別培養基。置于（36±1）℃培養，所有平板中，除BS瓊脂平板培養40-48小時，其余平板培養18-24小時。觀察培養結果，如各個平板上無菌落生長則判斷為陰性，無需進一步實驗；如各個平板上有菌落生長，則根據沙門菌在各鑒別培養基平板上的菌落特征，進行是否污染菌為沙門菌的初步判斷。

1.2.4生化試驗

生化試驗所用培養基為三糖鐵瓊脂培養基、賴氨酸脫羧酶培養基，接種菌落至營養瓊脂平板的目的為分離純化，為血清學分型鑒定做準備。在生化試驗中，沙門菌屬的反應結果應與相應結果符合。

1.2.5血清學分型鑒定

符合上述生化反應特征者，用沙門菌多價血清進行鑒定。若血清凝聚，則診斷為該種沙門菌。

1.3結果與報告

結果報告描述為：25g或25mL樣品中檢出或未檢出沙門菌。

2.金黃色葡萄球菌

2.1生物學概述

葡萄球菌廣泛分布于自然界中，大多數是非致病菌，少數有致病性，能引起人和動物各種化膿性疾病和葡萄球菌病，是臨床上常見的呼吸道、消化道致病菌。食品受到葡萄球菌的污染，在適宜條件下，能產生腸毒素，引發食物中毒。

2.1.1形態及染色

典型的金黃色葡萄球菌為球型，無芽孢、鞭毛，呈葡萄串狀分散排列，故涂片時切勿涂片太厚。革蘭染色陽性。

2.1.2培養特性

金黃色葡萄球菌營養要求低，需氧、兼性厭氧條件均可生長。有高度的耐鹽性，在10%-15%NaCl肉湯（高鹽肉湯）中生長良好。

在血瓊脂平板上形成的菌落較大，菌落周圍形成β溶血環。在Baird-Parker平板上生長時，菌落呈較小灰黑色，在其外層因產生蛋白水解酶有一透明帶。

2.1.3生化特性

分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產酸不產氣。致病菌株能液化明膠，在厭氧條件下分解甘露醇，產酸，不產生靛基質。

2.2定性檢驗方法

2.2.1樣品處理

利用金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性的特征。方法如下：稱取25g（mL）樣品放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯中，注意不能均勻分布于稀釋液的樣品需用無菌均質杯/均質袋或勻漿儀，以8000-10000轉/分的速度，均質1-2分鐘，即保證樣品中微生物均勻分布于7.5%氯化鈉肉湯中。若樣品為液態，則混勻即可。

2.2.2增菌和分離培養

將上述樣品勻液于（36±1）℃培養18-24小時。金黃色葡萄球菌因其高度耐鹽性，在含有7.5%氯化鈉的肉湯（高鹽環境）中應旺盛生長，培養基應呈渾濁。故如高鹽培養液由澄清變為渾濁，則說明培養液中有金黃色葡萄球菌生長繁殖，但仍需根據培養特性做進一步檢驗：

將上述培養物，劃線接種到Baird-Parker平板，（36±1）℃培養24-48小時。同時將上述培養物劃線接種到血平板，（36±1）℃培養18-24小時。

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上菌落較小，顏色呈較小灰黑色。在血平板上，形成圓形、有β溶血環的較大菌落。上述實驗結果基本可判定樣品中有金黃色葡萄球菌，但食品微生物檢測的嚴謹性決定檢驗結果需進一步檢定，故挑取上述菌落進行染色鏡檢和血漿凝固酶試驗。

2.2.3鑒定

2.2.3.1革蘭氏染色法染色鏡檢

結晶紫初染→碘液媒染→乙醇脫色→沙黃復染。原理如下：

結晶紫作為初染液先將所有細菌染成紫色，染色時間1分鐘。由于菌體和染液結合不夠緊密，故碘液作為媒染液，使菌體和結晶紫結合更加緊密，不易被乙醇脫色，染色時間1分鐘。乙醇脫色（30秒）步驟開始，菌體顏色出現分化：革蘭氏陽性菌因為細胞壁厚，初染液結晶紫被牢固的保存于菌體內，使細菌保持紫色；革蘭氏陰性菌因為細胞壁薄，初染液結晶紫很容易被脫色液乙醇洗脫，故使菌體呈現無色。最后復染液沙黃作用于菌體，革蘭氏陽性菌依然保持紫色；革蘭氏陰性菌被染成紅色，染色時間1分鐘。

金黃色葡萄球菌染色結果為紅色革蘭陽性菌，球形，排列呈葡萄球狀。

2.2.3.2血漿凝固酶試驗

挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落，進行血漿凝固酶試驗。

2.2.4結果判定

在血平板、Baird-Parker平板的菌落特征、鏡檢結果均符合金黃色葡萄球菌的特征，血漿凝固酶試驗陽性結果，可判為金黃色葡萄球菌陽性。結果報告描述為：25g或25mL樣品中檢出或未檢出沙門菌。