施用三環唑與二氯喹啉酸對水稻土細菌的影響

張冰，王玖程，汪冬至，馮建騁，侯文峰，周雪，高強

（吉林農業大學資源與環境學院，長春 130118）

三環唑是防治稻瘟病專用的內吸性殺菌劑，隸屬于噻唑類，其殺菌機理是通過抑制孢子的萌發和附著孢的形成，阻止病菌入侵和減少稻瘟病菌孢子的產生[1]。自1987 年首次在我國河北省推廣并利用三環唑防治稻瘟病開始，至今已有30多年[2]。二氯喹啉酸是一種激素型且具有高選擇性的水田專用化學除草劑[3]，其作用機理在于促進ACC（1-氨基環丙烷-1-羧酸）在幼芽組織中合成并產生乙烯和氰化物，其大量積累后會產生毒害作用，導致雜草幼苗的黃化、失綠、壞死[4-5]。二氯喹啉酸自20 世紀80 年代末開始被大面積的推廣使用，距今已有30多年[6]。

目前有關三環唑的研究主要集中在不同施用劑量對稻瘟病的防治效果[7-8]以及施用后其降解、殘留等污染情況與相應修復技術[9-10]，微生物方面主要聚焦于相關降解[11]和拮抗菌株[12]的富集與篩選。二氯喹啉酸的相關研究主要集中在作用效果[13]、降解機制[14]、抗性機制[15]等方面，微生物方面主要關注降解菌的分離、鑒定[16]以及通過添加外源菌劑修復受二氯喹啉酸污染的土壤等方面[17]，也有一些研究利用磷脂脂肪酸分析（PLFA）技術分析培養條件下二氯喹啉酸對土壤微生物群落結構的影響，結果顯示稻田淹水情況不同，二氯喹啉酸對土壤微生物穩定性的影響不同，但均具有含有相同標致性脂肪酸（14：0、15：0、16：0和18：2n6c）[18]的優勢類群，這說明施用二氯喹啉酸會產生特異的優勢類群。

三環唑和二氯喹啉酸在水稻種植中被廣泛使用，但有關其對稻田土壤細菌多樣性以及群落結構實際變化影響的研究較少。農藥對土壤微生物群落結構影響的研究主要采用室內培養，技術手段為磷脂脂肪酸技術。本文以吉林省永吉縣的稻田土壤為研究對象，分別添加不同劑量（推薦施用量以及2 倍推薦施用量）的三環唑和二氯喹啉酸，利用高通量測序技術研究施用不同時間后其對土壤細菌多樣性和群落結構的影響，以期為安全與合理使用三環唑與二氯喹啉酸提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地點位于吉林省吉林市永吉縣一拉溪鎮鞠家村（43°47'42.98″N，126°06'49.57″E），永吉縣為吉林省水稻主產區，該試驗區常年施用三環唑和二氯喹啉酸。試驗地屬于北溫帶半濕潤大陸季風性氣候，年平均日照時間約為2 600 h，日照充足，年均氣溫6.5 ℃，年均降水量在200~700 mm 之間。供試土壤為白漿型水稻土，基礎理化性質如下：pH 5.3，有機質15.7 g·kg-1，堿解氮89.6 mg·kg-1，速效磷45.7 mg·kg-1，速效鉀151.1 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

本研究采用三環唑250 g·hm-2懸浮劑，推薦施用量（低劑量）750 g·hm-2，有效成分187.5 g·hm-2，2倍推薦施用量（高劑量）1 500 g·hm-2，有效成分375 g·hm-2。50%二氯哇琳酸可濕性粉劑，推薦施用量（低劑量）450 g·hm-2，有效成分225 g·hm-2，2 倍推薦施用量（高劑量）900 g·hm-2，有效成分450 g·hm-2。試驗共設5 個處理：未施用三環唑和二氯喹啉酸處理（CK）、低劑量施用三環唑處理（TL）、高劑量施用三環唑處理（TH）、低劑量施用二氯喹啉酸處理（QL）、高劑量施用二氯喹啉酸處理（QH）。農藥采用手動噴灑方式施加，分別在第0、30、107 天進行土壤樣本采集（其中0 d 采集樣本即為CK 處理），并迅速去除土樣中可見的動植物殘體及石塊等，土樣一部分帶回實驗室風干，用于土壤理化性質測定，一部分用干冰保存運輸，-80 ℃冰箱儲存用于微生物送檢。

1.3 土壤化學性質測定

土壤化學性質測定參照《土壤農化分析》[19]。通過電位法使用復合電極測定土壤pH；重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機質含量；堿解擴散法測定土壤堿解氮含量；NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量；NH4OAc浸提-火焰光度法測定速效鉀含量。

1.4 DNA提取、Illumina測序和數據處理

選 用OMEGA Soil DNA Kit（D5625-01，Omega Bio-Tek，Norcross，GA，美國）試劑盒，按試劑盒的標準步驟進行土壤總DNA 的提取。選用長度約為468 bp 的細菌16S rRNA 基因的高度可變的V3~V4 區測序。PCR 擴增選用細菌16S rDNA V3~V4區特異性引物338F（5'-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）。16S rDNA 基因的測序在Illumina NovaSeq 上完成，首先調用qiime cutadapt trim-paired 切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，然后通過qiime dada2 de?noise-paired 調用dada2進行質控、去噪、拼接、去嵌合體，完成所有文庫的去噪后，合并ASVs 特征序列和ASV 表格，并去除singletons ASVs，最終基于Silva 數據庫（Release132）進行物種注釋。

1.5 數據分析

采用Excel 2019 軟件進行數據處理。基于R 語言（4.1.3）中的vegan包，計算細菌群落的Shannon 指數和Chao1 指數，并進行Kruskal-Wallis 檢驗和Dunn's test 檢驗的顯著性標記（P<0.05）以及NMDS 分析；利用RColorBrewer 包進行基于Bray-Curtis 距離的ANOSIM 分析；利用ggplot2 包進行豐富-稀有物種的統計分析、繪圖[20][稀有類群（ART）為在所有樣本中豐度均≤0.1%的ASV，豐富類群（AAT）為在所有樣本中豐度均≥1%的ASV，中間類群（MT）為在所有樣本中豐度均>0.1%且<1%的ASV，條件稀有類群（CRT）為在所有樣本中豐度均<1%且僅在部分樣本中豐度<0.1%的ASV，條件豐富類群（CAT）為在所有樣本中豐度均>0.1%且僅在部分樣本中豐度>1%的ASV，條件稀有或豐富類群（CRAT）為豐度跨越從稀有（最低豐度≤0.1%）到豐富（最高豐度≥1%）的ASV]，計算ASV在各組樣本中的特異性和占有率，并以閾值>0.7為條件進行特化種的判定以及繪制SPEC-OCCU圖[21]。

2 結果與分析

2.1 三環唑與二氯喹啉酸對土壤細菌α多樣性的影響

圖1、圖2 分別為三環唑與二氯喹啉酸施用不同天數后稻田土壤細菌群落Simpson 指數和Chao1 指數箱線圖。30 d 時，與CK 相比，施用三環唑對Simpson和Chao1 指數的影響均表現為低劑量施用時指數下降，高劑量施用時指數提高；施用二氯喹啉酸對Simp?son 指數的影響與三環唑一致，而高劑量和低劑量施用均造成了Chao1 指數的下降。107 d 時，同CK 相比，三環唑只有低劑量施用降低了Chao1 指數，而高劑量下的Chao1 指數和兩種劑量下的Simpson 指數均升高；二氯喹啉酸只有高劑量施用提高了Simpson 指數，而低劑量下的Simpson 指數和兩種劑量下的Chao1 指數均降低。但不論是低劑量還是高劑量，與未施藥（CK）相比，施用時長對Chao1 指數和Simpson指數的影響均不顯著（P>0.05），說明三環唑與二氯喹啉酸的添加對稻田土壤細菌α多樣性無顯著影響。

圖1 稻田土壤細菌群落的Simpson指數Figure 1 Simpson index of paddy soil bacterial communities

圖2 稻田土壤細菌群落的Chao1指數Figure 2 Chao1 index of paddy soil bacterial communities

2.2 三環唑與二氯喹啉酸對土壤細菌β多樣性的影響

通過NMDS 分析三環唑與二氯喹啉酸對稻田土壤細菌群落的影響（圖3a），結果表明在施用三環唑和二氯喹啉酸后的不同時間，不同處理的稻田土壤細菌群落結構均出現了明顯的聚類分離。基于Braycurtis 距離的ANOSIM 分析結果表明（圖3b 至圖3e），0 d 時，各稻田土壤樣本之間微生物群落結構無顯著差異（P>0.05）。30 d時，同CK 相比，施用三環唑和二氯喹啉酸均使稻田土壤細菌群落結構產生了顯著差異，且高劑量施用引起的細菌群落結構差異大于低劑量施用；107 d時，同CK相比，三環唑和二氯喹啉酸的施用均使稻田土壤微生物群落產生了顯著差異，且高劑量施用引起的差異大于低劑量。由此可知，三環唑與二氯喹啉酸的施用時長顯著影響了稻田土壤細菌群落結構，且高劑量施用對細菌群落結構的影響大于低劑量施用。

圖3 稻田土壤細菌群落NMDS分析及ANOSIM相似性分析Figure 3 NMDS analysis and ANOSIM similarity analysis of soil bacterial communities in paddy fields

2.3 三環唑與二氯喹啉酸施用時長對土壤細菌物種組成的影響

2.3.1 對物種組成的影響

圖4 為三環唑與二氯喹啉酸施用后稻田土壤細菌群落門水平物種組成豐度圖。在三環唑與二氯喹啉酸處理門水平的物種中，Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria 的總占比大于85%，為主要物種，其中Proteobacteria 菌門豐度占比最高（30%~35%）。第0 天各稻田土壤樣本之間豐度前20 的門水平注釋結果無顯著差異；同CK 相比，施用三環唑30 d 提高了Acidobacteria 菌門的相對豐度，降低了Actinobacteria 菌門的相對豐度，并表現出高劑量施用對菌門相對豐度的提高和降低程度大于低劑量施用；施用二氯喹啉酸30 d 提高了Chloro?flexi、Acidobacteria 菌門的相對豐度，降低了Proteo?bacteria 菌門的相對豐度，且高劑量施用對菌門相對豐度的提高、降低程度大于低劑量；施用三環唑107 d提高了Chloroflexi、Acidobacteria 菌門的相對豐度，降低了Proteobacteria、Actinobacteria 菌門的相對豐度，高劑量施用的影響大于低劑量；施用二氯喹啉酸107 d 提高了Acidobacteria 菌門的相對豐度，高劑量施用影響大于低劑量，降低了Actinobacteria菌門的相對豐度，低劑量施用影響大于高劑量。在不同時間，不同處理對門水平物種組成造成了不同程度的影響，且普遍表現為高劑量施用對稻田土壤微生物群落結構的影響大于低劑量施用。

圖4 稻田土壤細菌群落豐度前20的門水平物種組成豐度圖Figure 4 Abundances of top20 phylum horizontal species in soil bacterial communities in paddy fields

2.3.2 對豐富和稀有類群的影響

圖5 為三環唑與二氯喹啉酸施用后稻田土壤細菌群落中優勢與稀有物種的豐度圖。目前對土壤微生物的豐度研究較多關注于總類群和高豐度類群，而本研究關注了低豐度的稀有類群，結果表明三環唑與二氯喹啉酸施用對稀有和條件稀有類群造成了影響。整體觀測趨勢為：TL、TH 處理和QL、QH 處理在30 d和107 d時，稀有類群的相對豐度均降低，且高劑量施用對稀有類群相對豐度的降低程度大于低劑量施用；條件稀有類群的相對豐度增高，且低劑量施用增加程度大于高劑量。三環唑和二氯喹啉酸的施用主要影響了稀有和條件稀有類群，最終均造成了稀有類群減少，條件稀有類群增加，而沒有影響中間和條件豐富類群的相對豐度，因此三環唑和二氯喹啉酸的施用更偏向于影響低豐度類群。

2.3.3 對潛在關鍵物種（特化種）的影響

圖6 為三環唑與二氯喹啉酸施用后稻田土壤細菌群落中潛在關鍵物種（特化種，特定于處理的同時又在大多數生境中常見的物種）的分析圖，圖7 為進一步的特化種組成分析圖。施用三環唑和二氯喹啉酸產生的特化種不同，施用三環唑處理產生的特化種主要隸屬于16 個菌門，其中低劑量施用三環唑產生的特化種所屬菌門8 個，高劑量施用產生的特化種所屬菌門13 個，共有菌門5 個，低劑量施用產生的特化種所分布的特有菌門為Actinobacteria、Cyanobacteria和Firmicutes 菌門，高劑量施用產生的特化種所分布的特有菌門為Elusimicrobia、Fibrobacteres、Kiritimati?ellaeota、Latescibacteria、Nitrospirae、Verrucomicrobiav、WOR-1 和WPS-2 菌門，高劑量施用三環唑產生的特化種所分布的菌門種類多，說明在三環唑的施用中高劑量施用對特化種的影響更大。施用二氯喹啉酸處理產生的特化種主要隸屬于12 個菌門，其中低劑量和高劑量施用二氯喹啉酸產生的特化種所屬菌門均為11個，共有菌門10個，低劑量施用產生的特化種所分布的特有菌門為Zixibacteria，高劑量施用產生的特化種所分布的特有菌門為Cyanobacteria，說明高劑量施用和低劑量施用二氯喹啉酸產生的特化種雖分布的門數相同，但實際分布的菌門并不相同。本研究最終發現：不同處理對共有的特化種菌門豐度均造成了影響，普遍規律為高劑量施用的影響大于低劑量施用；施用三環唑產生更多的特化種，其所分布的特有菌門（7 種）高劑量施用6 種，低劑量施用1 種，而二氯喹啉酸施用只在低劑量下具有1個特有菌門。

圖6 稻田土壤細菌群落潛在關鍵物種（特化種）分析Figure 6 Analysis of potential keystone species（specialized species）of paddy soil bacterial communities

圖7 稻田土壤細菌群落潛在關鍵物種（特化種）組成分析Figure 7 Analysis of the composition of potential keystone species（specialized species）in paddy soil bacterial communities

3 討論

近年來，三環唑和二氯喹啉酸的廣泛施用在一定程度上改變了稻田土壤微生物群落結構[22]，本研究通過田間試驗發現，不論高劑量還是低劑量施用三環唑和二氯喹啉酸均不影響土壤α 多樣性指數。García-Jaramillo 等[23]研究三環唑對土壤微生物群落的影響發現，隨著水稻生長，三環唑不會影響細菌和真菌群落的多樣性，這與本文研究結果一致，分析原因可能是三環唑與二氯喹啉酸的施用對微生物群落的影響特異性低，專一性較高。謝泰祥等[24]的研究結果表明微生物的定殖與變化具有不同的喜愛偏好，其主要受外界不同因素的影響，可歸因于微生物的生態專一性和多樣性。但不同劑量三環唑和二氯喹啉酸與CK處理相比均顯著影響了稻田土壤細菌群落結構，在施用不同時間后，時間不同處理的稻田土壤細菌群落結構均隨著時間的演替，出現了明顯的聚類分離。30 d和107 d 時，三環唑和二氯喹啉酸處理均是高劑量施用的影響大于低劑量施用，這與張妤[25]、楊彩宏等[26]利用磷脂脂肪酸法研究二氯喹啉酸對土壤微生物群落結構的影響結論一致。因此，高劑量施用三環唑和二氯喹啉酸對稻田土壤微生物群落結構的影響比低劑量施用更大。

在物種水平上進行分析發現，三環唑和二氯喹啉酸處理豐度前20 的門水平物種同樣受高劑量影響大于低劑量，其中優勢菌門為Proteobacteria 菌門[17]。其他研究也表明施用農藥后Proteobacteria 為優勢菌門[27]。將不同豐度的ASV 劃分為豐富和稀有類群，發現三環唑和二氯喹啉酸的施用均造成稀有類群的減少，條件稀有類群的增加，中間類群和條件豐富類群并未受到影響。李濤等[28]在乙草胺對農田土壤動物群落結構的影響研究中得出乙草胺施用主要是對常見類群和稀有類群的影響，這與本文研究結果趨同，均表明農藥的添加與施用更偏向于對稀有類群的影響。Pedrós-Alió 等[29]發現豐富的物種生長速度快，適應性好，而稀有物種生長速度慢，對外界條件更為挑剔。因此，土壤稀有微生物可能對環境變化更為敏感。本文通過計算物種的特異性和占有率來尋找可歸屬于不同處理的潛在關鍵物種（特化種），并分析在施用三環唑和二氯喹啉酸條件下，共有特化種的相關豐度變化以及特異性差異組成，研究結果表明，特化種中共有的Acidobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimon?adetes、Chloroflexi、Proteobacteria 5 個菌門的相對豐度均受到不同程度的影響，且高劑量施用對菌門相對豐度的影響大于低劑量施用，高劑量與低劑量施用對微生物的穩定性及豐度均造成不同程度的影響[30]。同時在對特化種組成進一步分析中發現，施用三環唑處理產生的特異性物種及其分布的菌門遠多于施用二氯喹啉酸處理，且高劑量施用的影響大于低劑量施用。目前對農藥處理下特化種的研究較少，大多研究主要集中于施用農藥與除草劑后土壤微生物群落結構[31]和物種組成的變化情況[32]。

4 結論

通過田間試驗發現，三環唑和二氯喹啉酸的施用對稻田土壤細菌α多樣性無顯著影響，但顯著影響了細菌群落結構，且高劑量施用的影響大于低劑量施用，最終導致稀有類群的減少，條件稀有類群的增加。下一步可針對三環唑和二氯喹啉酸施用導致的土壤微生物整體群落功能及特化種功能的變化進行深入研究。