六溴環十二烷（HBCD）和Cu2+單獨與聯合暴露對海水小球藻的毒性作用

賴麗華，田斐，熊倩，王學鋒，葉國玲，陳海剛*

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東省漁業生態環境重點實驗室，農業農村部南海漁業資源環境科學觀測實驗站，廣東珠江口生態系統野外科學觀測研究站，廣州 510300；2.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

阻燃劑是水環境中的一類新興污染物，其中六溴環十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD）是一種常用的溴化阻燃劑，因其成本低、阻燃效果好等優點，廣泛應用于塑料聚合物、電子產品和建筑材料的生產中[1]。研究表明HBCD 具有持久性、生物積蓄性、遠距離遷移性等，可引起內分泌干擾作用、神經毒性和生殖發育毒性等[2–5]。由于沒有性能好且足夠安全的替代品，HBCD 在我國還需延用至2024 年，因此，了解HBCD 在環境中的生態風險至關重要[6]。此外，重金屬也是水環境中廣泛關注的一類污染物，其中銅被認為是毒性最強的金屬之一[7]。高濃度Cu2+會干擾藻類的生長和光合作用，并在食物鏈和食物網中傳遞，威脅生物體和人類的健康[8]。通常Cu2+在海水中的濃度為0.03~0.60 μg·L-1，但在受工業活動、生活污水和電子垃圾等污染的沿海水域，其濃度可能會增加數倍[9-10]。研究發現，在電子廢棄物處理區周圍的海水環境中，高濃度的溴化阻燃劑和重金屬共存現象非常普遍。例如，在渤海海岸水體中，發現HBCD 濃度高達5 080 ng·L-1，Cu2+濃度最高可達39.99 μg·L-1，這也是目前為止在水體中可檢測到的HBCD 和Cu2+的最高濃度[11-12]。

溴化阻燃劑和重金屬混合暴露對生物體的毒性常表現為比單獨暴露更高，如：Chen等[13]研究發現，與僅暴露于鎘處理的小鼠相比，同時暴露于四溴雙酚A和鎘的小鼠體質量和肝臟質量明顯增加；十溴聯苯醚的添加不僅增強了鉛對赤子愛勝蚓的毒性[14]，還會加劇鎘對人體肝細胞的損傷[15]。溴化阻燃劑和重金屬的持續釋放可能會對水生系統造成多重壓力，已證實單一污染物具有一定的毒性效應，但針對它們的聯合毒性效應研究仍十分匱乏，因此有必要深入探究污染物聯合暴露對水生生物的影響。

海岸帶獨特的地理位置和頻繁的人類活動使其成為污染物的最大的匯，因此研究沿海水域中污染物對水生生物的毒性效應迫在眉睫。目前針對溴化阻燃劑和重金屬的生物毒性研究普遍以動物作為生物受試體，缺乏溴化阻燃劑和重金屬對微藻的毒性研究。藻類作為海洋生態系統中的重要初級生產者之一，其分布廣泛、適應能力強、易獲得、繁殖快且對污染物敏感性高，故常被選作污染物毒性評估和水質安全評價的模式生物[16]。本研究以普通海水小球藻（Chlorella salina）作為生物受試體，探究HBCD 和Cu2+單獨和聯合暴露對海水小球藻毒性作用，以期為HBCD、Cu2+及其混合物的生態風險評估和污染防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HBCD（純度：99%）和CuSO4·5H2O（純度：99%）購自上海麥克林科技有限公司。丙酮作為溶劑用于制備HBCD 儲備液（1 g·L-1），實驗中控制其添加比例為0.05%（V/V）。本實驗所用海水采集于中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地，溫度為29~32 ℃，鹽度為28~32，為保證每次實驗培養條件一致，根據該藻種培養條件預實驗結果調整鹽度為30、pH為8，采用0.45 μm 醋酸纖維濾膜將其過濾，高溫高壓滅菌后用于實驗。海水小球藻種和F/2 培養基購自上海光語科技有限公司。

1.2 藻種及其培養

將海水小球藻接種到無菌的F/2 培養基中，于培養箱內靜置培養，培養條件為：溫度（25±1）℃，光照強度54~74 μmol·m-2·s-1，光暗比為14 h∶10 h。每日定時手動搖勻藻液3 次，以防止藻細胞沉降，同時更換位置以保證樣品受光均勻。收集培養至對數生長期的藻細胞，將其用作毒性實驗的接種物。所有實驗均在無菌條件下進行，以避免細菌或其他藻類的污染。

1.3 急性毒性實驗步驟

HBCD、Cu2+及其混合物對海水小球藻的毒性測試實驗方案參考文獻[17]，設置藻種初始濃度（以cell計）為5×104個·L-1。預實驗結果發現，HBCD 濃度在3 500 μg·L-1以上處理組間的結果沒有顯著差異，Cu2+濃度達到2 000 μg·L-1海水小球藻幾乎被完全抑制，而HBCD 濃度在50 μg·L-1以下和Cu2+濃度在200 μg·L-1以下處理組的結果表現為微弱的促進作用，因此，濃度設置按照等對數間距法將HBCD 暴露濃度設置為0、50、160、500、955、1 830 μg·L-1和3 500 μg·L-1，Cu2+的暴露濃度設置為0、200、315、500、795、1 260 μg·L-1和2 000 μg·L-1。為了深入研究添加HBCD 是否會影響Cu2+對海水小球藻的毒性，選擇目前調查的最高環境濃度5 μg·L-1和前面單獨暴露對海水小球藻毒性最大的500 μg·L-1兩個HBCD 濃度與7 組不同濃度的Cu2+（0、200、315、500、795、1 260 μg·L-1和2 000 μg·L-1）進行聯合毒性實驗。各處理組設置3個平行，培養條件同1.2，培養96 h后取樣測定藻細胞密度、Chl a 含量，并利用FluorPen 手持式葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數。

1.4 數據處理

采用SPSS 25 對實驗數據進行統計分析，不同濃度處理間對海水小球藻細胞密度、Chl a 含量和葉綠素熒光參數的影響采用單因素方差分析，顯著性差異采用LSD 法進行多重比較，Probit 程序計算半數效應濃度（EC50）值。細胞密度抑制率計算公式如下：

細胞密度抑制率（%）=[（對照組細胞密度-處理組細胞密度）/對照組細胞密度]×100%

2 結果與分析

2.1 HBCD單獨暴露對海水小球藻的影響

不同濃度HBCD 脅迫下，海水小球藻的細胞密度呈現不同程度的抑制效應，而Chl a 和PSⅡ最大光化學量子產量Fv/Fm無顯著變化。如圖1所示，500 μg·L-1HBCD 處理組對藻細胞密度的抑制效應最強（32.99%），其次依次為50（24.76%）、1 830 μg·L-1（21.04%）和3 500 μg·L-1（19.95%）處理組。Chl a 含量的變化趨勢與細胞密度不同，500 μg·L-1HBCD 處理組，Chl a 含量比對照組僅降低了13.42%，而1 830 μg·L-1處理組中Chl a含量的抑制率最高（36.45%）。

圖1 HBCD脅迫對海水小球藻的影響Figure 1 Effects of HBCD stress on C.salina

2.2 Cu2+單獨暴露對海水小球藻的影響

如圖2 所示，不同濃度Cu2+脅迫下，海水小球藻的細胞密度、Chl a 含量和Fv/Fm 發生明顯變化。當Cu2+濃度≤500 μg·L-1時，藻細胞密度受到輕微抑制，而當其濃度為795、1 260 μg·L-1和2 000 μg·L-1時，藻細胞密度顯著下降，較對照組分別降低了75.71%、92.88%和96.80%，且在培養24 h 后出現明顯的絮凝沉淀，Chl a 含量也較對照組分別降低了72.83%、87.53%和96.77%。此外，低濃度Cu2+處理組對Chl a含量的影響大于其對藻細胞密度的影響。Cu2+濃度≤795 μg·L-1處理組，Fv/Fm無明顯變化，而Cu2+濃度為1 260 μg·L-1和2 000 μg·L-1時，Fv/Fm 與對照組相比顯著降低，分別下降了24.24%和32.32%。Cu2+單獨暴露時，基于細胞密度和Chl a 計算的96 h-EC50分別為637 μg·L-1和541 μg·L-1（表1）。

圖2 Cu2+脅迫對海水小球藻的影響Figure 2 Effects of HBCD and Cu2+stress on C.salina

2.3 HBCD和Cu2+聯合暴露對海水小球藻的影響

HBCD和Cu2+聯合暴露對海水小球藻細胞密度和Chl a含量的影響如圖3所示。HBCD和Cu2+聯合暴露對海水小球藻的抑制率高于Cu2+單獨暴露，其抑制率隨HBCD 濃度增加而顯著增高。當Cu2+濃度為500 μg·L-1時，5 μg·L-1和500 μg·L-1HBCD 聯合處理組中細胞密度抑制率均顯著高于Cu2+單獨暴露，分別為Cu2+單獨暴露的2.5 倍和5.4 倍（圖3A）。在Cu2+濃度為315 μg·L-1處理組中，5 μg·L-1HBCD 聯合脅迫下Chl a 含量抑制率低于Cu2+單獨暴露處理組，而在500 μg·L-1HBCD 聯合脅迫下Chl a 含量抑制率則顯著升高，其抑制率是Cu2+單獨暴露的2.3 倍（圖3B）。當Cu2+和HBCD 濃度均為500 μg·L-1時，Chl a 含量抑制率是Cu2+單獨暴露處理組的2倍（圖3B）。

圖3 HBCD和Cu2+聯合暴露對海水小球藻的影響Figure 3 Effects of HBCD and Cu2+mixed exposure on C.salina

與Cu2+單獨暴露處理組相比，HBCD 和Cu2+聯合暴露處理組中PSⅡ最大光化學量子產量（Fv/Fm）和PSⅡ實際光化學量子產量（ΦPSⅡ）值均降低（圖4）。當Cu2+濃度為795 μg·L-1時，500 μg·L-1HBCD 處理組中Fv/Fm值顯著低于Cu2+單獨暴露，下降了29.2%，僅為0.44（圖4A）。在Cu2+單獨暴露處理組中，ΦPSⅡ和Fv/Fm 變化趨勢相同；當額外添加5 μg·L-1HBCD 時，ΦPSⅡ隨Cu2+濃度增加先緩慢升高后迅速降低；當添加500 μg·L-1HBCD 時，ΦPSⅡ則隨Cu2+濃度增加逐漸下降（圖4B）。

圖4 HBCD和Cu2+聯合暴露對海水小球藻葉綠素熒光參數的影響Figure 4 Effects of HBCD and Cu2+co-exposure on chlorophyll fluorescence parameters of C.salina

表1 給出了不同HBCD 添加濃度下，海水小球藻細胞密度和Chl a 含量對Cu2+的96 h-EC50變化情況。5 μg·L-1和500 μg·L-1HBCD 添加濃度聯合暴露處理組，由細胞密度得到的96 h EC10（262、199 μg·L-1）和EC50（513、403 μg·L-1）值與Cu2+單獨暴露均有顯著差異，且隨HBCD 濃度升高而降低。通過細胞密度計算的96 h-EC50明顯大于Chl a 含量計算結果，與上述細胞密度和Chl a變化情況相同。析因分析表明，HBCD和Cu2+聯合暴露對海水小球藻的影響呈現交互作用（P=0.001）。

3 討論

藻類常用于評估各類污染物毒性效應，但目前針對HBCD 對微藻的生態風險評估研究仍很有限。Bertucci 等[18]的研究表明HBCD 的細胞毒性高度動態，不遵循傳統的濃度反應模式，與本研究結果一致。在本研究中，高濃度HBCD 脅迫下海水小球藻的細胞密度高于低濃度的，且所有處理中藻細胞的抑制率均低于50%，可能是由于海水小球藻具有良好的光合活性和較強的抗氧化系統，足以抵御HBCD 的氧化脅迫[19]。低毒性的化合物暴露短時間內一般不會引起個體死亡，可能首先導致生物體的生理生化水平發生異常[20]。例如，Wu等[21]的研究發現低濃度HBCD暴露斑馬魚72 h 后，斑馬魚胚胎心率和心律失常增加，而存活率和整體畸形率未受到顯著影響，推測心臟可能是HBCD 的作用靶點。但在本研究中，發現HBCD 對微藻Fv/Fm 的影響不顯著，說明Fv/Fm 可能不適用于HBCD對微藻的毒性檢測。

Li等[22]的研究發現，Cu2+會影響微藻的生長，且當其濃度達到一定范圍會抑制藻細胞生長。在本研究中，也觀察到當Cu2+暴露濃度大于500 μg·L-1時藻細胞數量顯著下降，在一定濃度范圍內海水小球藻的細胞密度與Cu2+濃度呈劑量效應關系。在實驗過程中，高濃度Cu2+處理組出現藻細胞絮凝沉淀，推測其原因有：①高濃度Cu2+使微藻細胞失去懸浮生長的能力；②細胞集聚可以在表面形成黏液層，可以一定程度延緩和防止金屬的毒性作用[23]。Cu2+不僅抑制細胞生長，同時還損傷藻細胞光合色素。在光合作用中，光合色素是反映藻類光合效率的重要指標，Chl a 是藻類的主要捕光色素[24]。光合生物對重金屬敏感度較高，故Cu2+處理組海水小球藻Chl a 含量比細胞密度受到抑制程度更高，這主要是由于Cu2+破壞藻細胞的光合作用系統，導致Chl a含量下降，進而影響藻類的生長[25-26]。

HBCD和Cu2+是電子垃圾回收過程中釋放的主要有害物質[27]，然而目前關于其聯合暴露的毒性作用機制知之甚少，因此本研究展開HBCD 和Cu2+聯合暴露對海水小球藻的毒性作用研究。污染物引起的氧化應激是損傷微藻的主要方式，研究表明溴化阻燃劑和重金屬都會引起氧化應激，損傷葉綠體膜，并抑制抗氧化酶的活性[28-29]。在本實驗中，HBCD 和Cu2+聯合暴露下海水小球藻細胞密度和Chl a 含量降低，推測可能是HBCD 和Cu2+誘導微藻葉綠體產生大量活性氧引起脂質過氧化的結果?；旌衔廴疚镆蚋鹘M分物理化學性質不同而產生不同的影響，但各成分的混合比例起著重要的作用[30]。在本研究中，500 μg·L-1Cu2+與不同濃度HBCD組合對海水小球藻生長的影響有顯著差異，而低濃度Cu2+混合物處理組則未表現出類似規律，表明污染物本身的化學性質對聯合毒性的影響小于其濃度組合的影響。

在藻類光合作用研究中，葉綠素熒光動力學技術是一種簡單、無損傷的檢測方法[31]。葉綠素熒光與光合作用過程密切相關，對污染物響應敏感，其中Fv/Fm 和ΦPSⅡ是2 個反映光合效率的葉綠素熒光參數[32]。本研究發現，高濃度Cu2+處理下，Fv/Fm顯著降低，在Chen 等[33]的研究中也發現類似變化規律，可能是由于Cu2+破壞PSⅡ系統并強烈抑制光合電子傳輸速率。藻細胞密度的顯著下降進一步證實Cu2+誘導毒性并超過藻細胞的耐受極限，可能致使細胞結構斷裂解體，進而導致相關熒光參數下降[34]。此外，Cu2+還可通過破壞電子傳遞鏈和取代Chl a 分子中的Mg 來破壞光合系統[35]。然而，HBCD 對藻細胞光合作用的毒性機制仍未可知。有限的研究發現，溴化阻燃劑三（2，3-二溴丙基）異氰尿酸酯會抑制psbC 的表達，從而減少編碼蛋白質與Chl a 的結合，破壞PSⅡ反應中心[36]；還有研究發現溴化阻燃劑BDE-47 會影響類囊體膜的通透性[37]，并產生活性氧降解光合色素和破壞葉綠素結構[38]。本研究中，HBCD 單獨暴露時，Fv/Fm和ΦPSⅡ無明顯變化，而它們在HBCD 和Cu2+聯合暴露中隨HBCD 添加濃度的升高而降低，表明HBCD 加劇了Cu2+對微藻光合系統的損傷。

半數效應濃度（EC50）是劑量反應關系研究中廣泛運用的標準統計量，被認為是化合物毒性的決定因素[39]。小球藻屬隸屬于綠藻門，是水環境中分布最廣泛的類群之一。研究發現，同一屬的不同小球藻之間Cu2+的96 h-EC50差異明顯，蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的96 h-EC50為68 μg·L-1[40]，而橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea）的96 h-EC50為489 μg·L-1[41]，淡水普通小球藻（Chlorella vulgaris）的96 h-EC50為591 μg·L-1[42]，甚至 有些藻株的96 h-EC50可高達110.3 μmol·L-1（約7 059 μg·L-1）[43]。一般認為具有較大的比表面積的藻細胞能夠提供更多的金屬結合位點，隨著藻細胞表面吸附的Cu2+增多，其對藻細胞的毒性作用加強。本研究所用的海水小球藻對Cu2+脅迫的耐受性高于大部分的藻類，可能與其細胞較小、Cu2+的初始吸附量小有關[40]。污染物的敏感性會隨受試對象的形態和生理特征或本身形態而異，通常認為生理終點比生存終點具有更高的敏感性[44]。在本研究中觀察到基于Chl a 計算的96 h EC10和EC50更小，即Chl a 對污染物更為敏感。EC10、EC50、無觀察效應濃度（no observed effect concentration，NOEC）和最低觀察效應濃度（lowest observed effect concentration，LOEC）是評價污染物急性毒性的重要指標。在本研究中EC10和EC50隨污染物濃度顯著變化，而NOEC 和LOEC 則明顯變化。NOEC 和LOEC 與實驗設計和統計假設檢驗方法的選擇有關，EC10和EC50是基于劑量效應曲線獲得，因此認為選擇EC10和EC50更適合評價污染物的毒性。交互作用可以反映一個因素不同水平變化受其他因素不同水平影響，雙因素方差分析是最簡單且有效評價兩個污染物對實驗結果是否有交互作用的工具，在本研究中HBCD 和Cu2+對海水小球藻的影響具有交互作用[45]。

4 結論

（1）六溴環十二烷（HBCD）對海水小球藻的毒性低，96 h-EC50大于3 500 μg·L-1，HBCD對Chl a含量和Fv/Fm的影響不顯著。

（2）Cu2+對海水小球藻的毒性呈劑量依賴性抑制，基于細胞密度和Chl a 計算的96 h-EC50分別為637 μg·L-1和541 μg·L-1，Chl a 對Cu2+的響應高于細胞密度。

（3）HBCD 和Cu2+對海水小球藻的影響具有交互作用，同時HBCD 會加劇Cu2+對海水小球藻的毒性，表現為細胞密度、Chl a 含量、葉綠素熒光參數（Fv/Fm、ΦPSⅡ）和96 h-EC50降低，Chl a 對HBCD 和Cu2+聯合暴露的響應高于細胞密度。因此，溴化阻燃劑和重金屬一旦釋放，會引起水生生物中毒，進而威脅整個海洋生態系統。