氫氟酸對發酵前后玉米秸稈有機質結構的影響

宋鑫，胥漢杰，雷梣岑，張玉，李芳芳*

（1.昆明理工大學環境科學與工程學院，昆明 650500；2.云南省土壤固碳與污染控制重點實驗室，昆明 650500）

土壤有機質（Soil organic matter，SOM）是由不同降解程度的植物、動物以及微生物殘余物組成的混合有機體系[1]。植物殘體包含多種生物分子組成，如纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質、脂質和單寧酸[2]。在這些植物源性分子中，木質素通常被認為是植物向土壤輸入有機碳的關鍵來源，其對于SOM 的積累具有重要作用[3]。植物凋落物和土壤沉積物中許多有機質的組成信息來自于分子水平上對特定植物或微生物成分的化學分析[4]。木質素單體結構特征顯著、性質較穩定，在土壤中周轉時間較長，因而常被用作分子生物標志物來示蹤土壤有機質的來源、降解和積累[5]。目前，木質素主要包含三類單體：V 代表香草基單元體，S 代表紫丁香基單元體，C 代表肉桂基單元體[6]。研究中常用堿性氧化銅水解法將木質素分解成其基本單元，再借助這些化合物的比值來示蹤SOM 的降解和來源，例如，木質素單體V 和單體S 中對應的酸和醛的比值增加表明其側鏈氧化程度增加[7-9]。然而近些年來，研究者發現木質素的化學穩定性及其難降解性被過分高估。在SOM 穩定機制中，更多的研究指向礦物對SOM 保護的重要性[10-11]。值得注意的是，SOM 與礦物結合形成的有機無機復合體，雖然提高了SOM 的穩定性，但這可能會使得結合態有機質的提取變得更為困難，甚至導致這部分有機質無法被萃取和檢測，從而干擾了穩定SOM 的定性及定量分析[12]。

在過去的幾十年中，由于鐵鋁氧化物等磁性礦物會阻礙儀器測定的靈敏度，因此，研究者常用2%或者10%的氫氟酸（HF）作為核磁共振碳譜（13C NMR）分析固態有機質結構組成和分子生物標志物時的前處理試劑[12-13]。HF 處理土壤樣品或者污泥沉積物可以消除磁性礦物的干擾，釋放出更多有機碳，進而提高SOM 中官能團在13C NMR 譜圖中的響應和分子生物標志物的提取率[13-14]。另外，在HF 處理過程中，有機質結構也可能被改變，從而不再具備原始有機質的代表性[15]。HF 處理是濃縮復雜地質體中有機物的重要實驗方法，對于環境樣品的生物標志物、核磁共振等表征檢測都有重要的意義。但HF處理對于有機質結構的影響尚不清楚。研究表明，3 種不同種類的木質素和針鐵礦吸附后，鹽酸處理提取到的木質素的酸醛比[（Ad/Al）s、（Ad/Al）v]顯著增加，來源參數S/V、C/V沒有發生改變，說明側鏈氧化程度增加，但SOM 的母源結構沒有變化[16]。然而，Rumpel等[17]指出不同濃度的HF 處理后土壤中木質素分子組成發生了變化，（Ad/Al）v、（Ad/Al）s升高，S/V降低，表明經過HF處理后木質素的氧化程度更高，丁香基酚含量降低。此外，也有研究報道礦物去除后木質素的來源參數沒有發生改變，但是木質素大量流失[18-19]。這些爭議是因為以往研究主要關注于酸洗前后固體組成的變化而缺失了酸洗液中有機質信息。酸處理一方面可能是HF溶解了礦物，導致部分極性強的SOM 的釋放，如氧化程度高的木質素片段溶于水，另一方面可能是HF 水解了蛋白、多糖等特定SOM 的結構，使更多小分子有機物溶出，這可能依賴于SOM的組成和性質差異。

有機碳的積累和分解不僅取決于其含量，還取決于有機碳的化學成分，反過來化學組分又控制著有機碳的功能[20]。因此，本研究采用微生物發酵前后的玉米秸稈模擬土壤中降解程度不同的有機質，再用不同濃度（0、2%、10%）的HF 對其進行酸處理，借助13C NMR 和木質素分子生物標志物信息，識別HF 處理后不同降解程度有機質組成和性質的變化，并直接證明HF能否改變有機質的結構，同時結合元素分析、傅里葉紅外光譜（FIRT）和穩定碳同位素比值判斷HF對碳分餾的影響，從而綜合判斷不同濃度HF 處理后固體和酸洗液中木質素結構的變化情況，為土壤中木質素，特別是礦物保護強的木質素的提取提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品處理及保存

本實驗按照菌劑∶葡萄糖∶水=1∶5∶100（m∶m∶m）的比例配制發酵液，發酵液靜置6~8 h，等待微生物充分激活后，將發酵液逐層均勻噴灑在玉米秸稈上，控制發酵原料濕度在50%~60%，然后用泡沫箱子密封發酵20 d左右，得到發酵后的玉米秸稈[21]。將發酵完成后的玉米秸稈樣品采集回實驗室，玉米秸稈樣品自然風干后于60 ℃下烘干。再將樣品研磨粉碎，過20目篩。為了滿足表征的需求，取少量樣品進一步過70目篩。樣品均避光保存在常溫下，待下一步實驗。

1.2 HF預處理

稱取一定質量的發酵前后的玉米秸稈于離心管中，并按照樣品和酸液1∶2（m∶V）的比例加入配制好的HF 溶液，擰緊瓶蓋，放入搖床中，每隔2 h 離心1次，設置離心機參數4 000 r·min-1，15 min，離心后收集上清液，再重新加入酸溶液重復洗6~7 次，同時收集保存酸洗液[22]。HF 的配制：以10%HF 溶液為例，加250 g 的濃HF（40%質量濃度的HF 溶液），750 g 去離子水制成1 kg 酸溶液。將發酵前的固體玉米秸稈有機質命名為BS；發酵前的酸洗液命名為BL；發酵后的固體玉米秸稈有機質命名為AS；發酵后的酸洗液命名為AL。

將收集到的上清液依次倒入存放有活化好的XAD-8、XAD-4 離子交換樹脂的試管中。再用甲醇將離子交換樹脂中吸附的有機質反向洗脫出來，分別得到疏水有機質和過渡親水有機質，最后將洗脫液一起倒入活化好的陽離子交換樹脂試管中，再吸附其中的陽離子，收集流出后的溶液[23]，進行蒸發、冷凍干燥，得到的樣品用于后續表征。

1.3 實驗方法

元素分析測定：所有固體樣品研磨過70 目篩，使用元素分析儀專用的錫舟，加入2.0 mg 左右的樣品，將包好的樣品放入元素分析儀中進行樣品測定。將氦氣和氧氣閥門分別打開，均調至250 kPa，確保氦氣流量為140 mL·min-1，氧氣流量為100 mL·min-1。選擇CHNS 模式（燃燒爐和還原爐溫度分別為950 ℃和1 060 ℃）測定C、H、N、S 的含量，選擇O 模式（燃燒爐溫度在1 060 ℃）測定O的含量。

FTIR 測定[24]：將干燥的樣品和溴化鉀按照1∶200（m∶m）的比例在瑪瑙研缽中磨碎壓片，然后用壓片機再進行壓片，取出放入儀器（Varian 640-IR）的測定窗口中，設置掃描波長范圍4 000~400 cm-1，以8 cm-1精度掃描20次，以表征樣品官能團的性質。

13C NMR 測定[25]：固體樣品在600 Hz 核磁光譜（JE?OL ECZ600R）下進行核磁掃描，參數設置為x_Freq=150.90 Hz、x_sweep=400 ppm，contact time=3 ms、relax?ation dalay=2 s。

木質素的提取：堿性氧化銅水解法[26-27]。稱取0.5 g樣品于反應釜中，再加入15 mL 2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，通氮氣0.5 h 除氧，并迅速蓋上蓋子，在170 ℃烘箱條件下反應2.5 h。冷卻后，將上清液轉移至離心管中，并在3 500 r·min-1轉速下離心15 min。離心后的上清液另外轉移到新的50 mL 離心管中，用錫箔紙包好避光，加入6 mol·L-1的鹽酸使其pH 調至1 附近，靜置1 h。靜置后再次離心，取上層清液于分液漏斗中進行萃取，有機相轉入錐形瓶中。同時向錐形瓶中加入無水硫酸鈉吸水，靜置后將錐形瓶中的液體轉至圓底燒瓶中，蒸發濃縮至1 mL 左右，用2 mL乙酸乙酯潤洗，轉移到15 mL 液相瓶，氮吹干后定容，衍生化上機檢測。

1.4 GC-MS定量分析

提取的木質素利用氣相串聯質譜儀（Agilent，GC7890A，MS5975C）進行定量分析。升溫程序為：初始溫度65 ℃，保持2 min；以6 ℃·min-1的速率上升至300 ℃，并在300 ℃下保持20 min。載氣為氦氣，進樣體積為1 μL，分流比為2∶1。離子源和四極桿溫度分別為230 ℃和150 ℃，質量掃描范圍為50~650 Da，容積延遲時間為8 min[10]。采用外標法定量。

1.5 數據處理

數據處理采用Excel 2010，制圖采用Origin 2020和Excel 2010。本研究使用SPSS 26.0進行單因素分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 酸處理下發酵前后玉米秸稈的樣品表征

不同濃度HF處理發酵前后的玉米秸稈有機質元素分析見表1。不同濃度HF 處理下，BS 中C 含量基本維持在40%左右。與對照組（0%HF）相比，隨著HF 濃度的增加，BS 中N 含量增加17.48%~21.68%，O含量增加8.47%~16.67%，導致其C/N 降低，O/C 增加。與BS相比，AS經不同濃度的HF處理后，N含量明顯增加，C含量也有一定幅度增加，導致C/N明顯降低。AS中的H含量和O含量在不同濃度HF處理間的變化都不明顯，因而O/C 和H/C 的變化不明顯。酸洗過程中玉米秸稈質量損失（QS）為19.84%~24.19%，其中0%HF處理有機質的損失更多。

表1 不同酸處理下樣品的元素分析Table 1 Elemental analysis of different concentrations HF treatment

為了進一步探究不同濃度HF處理對秸稈有機質結構的影響，本實驗借助FITR 和13C NMR 直觀分析了有機質的官能團變化，其結果如圖1 和圖2 所示。與BS 相比，AS 沒有產生新的官能團吸收峰，只是吸收峰強度存在差異。不同濃度HF 處理后，固體樣品和酸洗液中的有機質官能團存在差異，固體樣品有機質在3 290 cm-1和1 560 cm-1附近振動，有機質主要在1 460 cm-1附近振動。進一步對比固體樣品13C NMR 發現，酸洗前后的主峰都集中在75 ppm 和105 ppm。通過計算13C NMR 中官能團的相對貢獻發現，酸洗后玉米有機質中官能團的相對貢獻降低，但是沒有產生新的位移，說明酸洗并不會改變有機質結構，更可能是使部分溶出性有機質流失。相對發酵前，發酵后玉米秸稈有機質的烷基對有機質官能團的貢獻由10%增加到20%，烷氧烴的相對貢獻從70%下降到50%左右，表明烷氧碳等易降解組分隨著發酵進程優先被降解，而難降解的有機質相對富集。

圖1 不同濃度HF處理后固體玉米秸稈有機質和酸洗液中紅外光譜圖Figure 1 FIRT spectrum of solids and supernatant after HF treatment with different concentrations

圖2 不同濃度HF處理后固體玉米秸稈有機質的核磁圖Figure 2 13C NMR of organic matter of solid corn straw treated with different concentrations of HF

2.2 酸處理下發酵前后玉米秸稈有機質中木質素含量和參數的變化

不同濃度HF處理的發酵前后玉米秸稈有機質中木質素的總量及參數變化如圖3所示。BS和AS有機質中木質素總量分別為（18.81±7.44）mg·g-1和（12.01±1.75）mg·g-1。AS 中V、S、C 單體及其總量與BS相比變化均不顯著，但是S和C單體含量明顯高于V 單體。氧化程度相同的玉米秸稈有機質，即BS 和AS，經0、2%和10%HF 處理后，木質素的總量沒有發生顯著的減少。此外，發酵前后玉米秸稈有機質中香草基木質素的（Ad/Al）v和來源參數（S/V 和C/V）都沒有顯著增加。

圖3 酸處理后發酵前后固體樣品中木質素總量及參數變化Figure 3 The changes of the total amount and structure of lignin in the solid before and after HF treatment

與0%HF 的酸洗相比，酸處理后的上清液中溶出性木質素含量更低，尤其是AL 的木質素含量降低得更為明顯。從表2 可知，不同濃度HF 處理后酸洗液中的木質素總量遠低于固體樣品。與0%HF 處理相比，2%HF 和10%HF 處理的上清液中木質素含量都很低，說明HF 基本不會改變有機質的結構進而導致其溶出，而更多的是水溶液導致的溶出。由于上清液中肉桂基單元體含量較低，未檢測出，因而未對其降解參數和來源參數進行分析。

表2 酸洗上清液中木質素含量及結構的變化Table 2 Changes in the lignin content and structure of the HF-washed supernatant

2.3 酸處理下發酵前后玉米秸稈有機質同位素變化

結合上文光譜學信息可知，上清液中有機碳的含量較低，故實驗中只分析了不同濃度酸處理后固體秸稈的同位素信息，結果見圖4。不同濃度酸處理后發酵前后固體玉米秸稈有機質的δ13C有顯著差異，其中發酵前玉米秸稈有機質的δ13C為-12.83‰±0.25‰，發酵后玉米秸稈有機質的δ13C 是-13.63‰±0.09‰。值得注意的是，發酵后的玉米秸稈有機質的δ13C顯著降低。然而，相同氧化程度的玉米秸稈有機質經不同濃度HF 處理后的δ13C 并沒有顯著性差異，說明酸處理不會使有機質發生分餾，氧化程度不同的玉米秸稈有機質經不同濃度HF 處理后OM 結構不會發生改變，只是發酵后降解程度高的有機質更容易流失。

圖4 酸處理對發酵前后固體玉米秸稈的同位素比值變化Figure 4 The δ13C value of maize straw before and after fermentation treat with HF

3 討論

3.1 發酵前后的玉米秸稈有機質的性質變化

發酵前后的玉米秸稈有機質存在一定的差異。表1 顯示，AS 的N 含量和C 含量顯著增加，O 含量顯著降低，但是其C/N 明顯降低。一方面可能是發酵過程中微生物的降解作用釋放了更多氨基化合物等含氮素的物質，另一方面O元素的流失導致C元素的相對富集，相比之下N的積累強于C的富集，因而導致發酵后C/N 降低[28]。根據圖4 穩定碳同位素分析可知，BS 的δ13C 值為-12.83‰±0.25‰，AS 的δ13C 值為-13.63‰±0.09‰，發酵后的玉米秸稈δ13C 值更加偏負，這與Lynch 等[29]報道的玉米秸稈堆肥后的δ13C 由-12.8‰±0.6‰變為-14.1‰±0.0‰相吻合。本研究中13C 貧化主要是因為短期發酵過程中微生物優先利用13C含量更高的多糖和蛋白質[30]。但是更多的文獻報道有機質降解過程會使13C 富集，這主要歸因于凋落物或者有機質的降解過程中微生物優先分解12C以及微生物殘體對于13C的貢獻[31-33]。另外，也有研究報道隨著降解時間的增加，整體的δ13C 呈先貧化再富集的趨勢，這可能是降解初期微生物優先利用13C高的易降解組分，后期礦物抑制了凋落物的降解導致了13C 富集[34]。隨著熱裂解技術（Py-GC/MS）的發展，San-Emeterio等[35]發現木質素、纖維素、蛋白質、脂質等特異性化合物中13C 都顯著富集，這歸因于降解過程中微生物對特定化合物中12C的優先利用。可見有機質的組成會改變δ13C，后期研究中可以考慮利用特異性化合物中的單體同位素識別有機質的降解。另外，發酵前后的玉米秸稈有機質FTIR 和13C NMR 都沒有新的位移，但是AS 的吸收峰明顯減弱，這可能是發酵過程中有機碳損失造成的[36]。對比AS 和BS，AS 的木質素總量有一定的降低，且AS 的降解程度大于BS，這也進一步證實了AS的溶出性更大。

3.2 不同濃度酸處理對玉米秸稈有機質的影響

圖1 和圖2光譜學數據顯示，不同濃度HF處理后玉米秸稈有機質組成和結構不會發生改變，這與研究報道的HF 處理不會改變有機質的13C NMR 具有一致性[37]。研究表明2%HF 處理會導致有機碳損失8%~17%，但是這些損失的有機碳不會對13C NMR 中化學結構信息造成顯著的影響[38]。同樣，本研究發現酸洗過程會導致有機質的流失，結合酸處理前后13C NMR信息和玉米秸稈有機質的質量損失分析，酸洗上清液中主要是易降解組分（如酰胺、氨基糖等），酸處理發酵前后的固體玉米秸稈有機質中都主要包含芳香族化合物和碳碳雙鍵類的化合物，但是不同濃度HF 處理不會導致有機質結構的改變[39-40]。不同濃度酸處理發酵前的玉米秸稈有機質中C含量基本保持不變。然而，酸處理發酵后玉米秸稈有機質的C含量明顯增加，O 含量降低，導致發酵后的玉米秸稈有機質中C元素相對富集。氧化程度相同的玉米秸稈有機質，經不同濃度的HF 處理后其δ13C 并沒有發生顯著的改變，HF 處理不會改變玉米秸稈有機質的碳同位素組成，這與研究報道的酸處理不會明顯改變δ13C 和δ15N信號值的結果具有一致性[17]。

不同濃度HF 處理發酵前后的玉米秸稈有機質后，木質素分子生物標志物信息顯示（圖3）HF不會顯著改變其降解參數，分子層面顯示HF 處理后玉米秸稈中木質素的降解程度相同。相反，有研究報道10%HF 處理不同深度的土壤有機質后，其來源參數和降解參數發生了改變，分子層面有機質結構發生了改變[17]。酸處理前后分子生物標志物出現不一致的情形極有可能是礦物對有機質保護所致。同樣，Li等[41]報道酸處理提高了游離態脂類化合物分子生物標志物的萃取，但是礦物去除前后其降解參數CPI 差異較大，甚至出現相反的趨勢。Chang 等[42]利用1 mol·L-1HCl/10%HF 去除土壤礦物后，苯多羧酸（Ben?zene-polycarboxylic acids，BPCAs）分子標志物的萃取量顯著升高。綜上所述，礦物嚴重阻礙了分子生物標志物的提取和識別，后續研究中有必要用溫和的酸先對礦物進行去除。

4 結論

（1）不同濃度HF 處理不會改變SOM 的結構，但HF 酸洗會導致溶出性有機碳的流失，尤其是發酵后高氧化程度的玉米秸稈有機質。為獲得高氧化程度有機質，實驗過程應選擇適宜濃度酸對固體樣品進行前處理，并對酸洗液進行濃縮純化，表征分析其理化性質，更好地評價整體有機質的組成變化。

（2）結合穩定碳同位素和分子標志物信息，HF處理不僅可以揭示礦物結合態有機質組分信息，而且還能提高分子標志物（木質素、脂類、BPCAs）的萃取率。酸處理前后分子標志物的信息變化為理解礦物對有機質的保護機制和不同土壤有機碳的周轉提供了研究思路。