UHPLC-MS/MS法測定瑞戈非尼中兩種痕量基因毒性雜質

陳爽,劉柱,石云峰,朱價,羅英

(浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江 杭州 310058)

基因毒性雜質(或遺傳毒性雜質,genotoxic impurity, GTI)是少量即能引起細胞DNA損傷,誘導基因突變,并具有致癌傾向的化合物[1]。歐洲藥品管理局(EMEA)、美國食品藥品管理局(FDA)及人用藥品注冊技術要求國際協調會(ICH)先后頒布了基因毒性雜質控制的指導文件[2-4],推薦以毒理學關注閾值(TTC,1.5 μg·d-1)來控制用藥風險,并發布基因毒性警示結構基團。

瑞戈非尼(Regorafenib)是拜耳藥業研發并于2017年3月在國內上市的一種新型口服多靶點的磷酸激酶抑制劑,本品以促進腫瘤血管生成和細胞增殖的多種蛋白激酶為靶標,達到治療晚期及轉移性結腸癌、進展期肝細胞癌、胃腸道惡性間質腫瘤、兒童神經母細胞瘤和膠質母細胞瘤及一些轉移性實體腫瘤的目的。瑞戈非尼的合成路線中起始物料SM2、SM3結構中均含有苯胺類基因毒性警示結構基團,具有潛在基因毒性,詳見圖1。

A.3-氟-4-氨基苯酚(SM2);B.3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(SM3)

SM2[3-氟-4-氨基苯酚(3-Fluoro-4-aminophenol)];SM3[3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(3-trifluoromethyl-4-phenylchloroisocyanate)]

SM2[3-氟-4-氨基苯酚(3-fluoro-4-aminophenol)];SM3[3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(3-trifluoromethyl-4-phenylchloroisocyanate)]

瑞戈非尼已收載于《中國藥典》和《歐洲藥典》,已經報道了一種LC-MS/MS法定量同時測定肝細胞癌患者血漿中瑞戈非尼中及其兩種活性代謝物的含量的方法[17],但目前也未見相關文獻報道本品中兩種苯胺類基因毒性雜質SM2、SM3的測定方法。因此建立超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)方法對瑞戈非尼中少量的苯胺類基因毒性雜質的含量進行控制。本研究依照ICH推薦的條件,建立了方法并從方法的專屬性、溶液穩定性、線性與范圍、定量限與檢測限、準確度、精密度方面進行了方法學研究,本法靈敏、可靠、簡便,為瑞戈非尼工藝過程控制和質量保障提供參考依據。

1 儀器與試劑

Agilent 1290-6470A LC-MS聯用系統(美國安捷倫),配備電噴霧離子源(AJS ESI),質譜軟件為Agilent MassHunter工作站;XS205DU百萬分之一電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)。Agilent RRHD C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,填料:十八烷基硅烷鍵合硅膠;Agilent 公司)。

3-氟-4-氨基苯酚對照品(批號:P1156811,純度:98%),3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯對照品(杭州華東醫藥集團新藥研究院有限公司,批號:191201,純度:99.76%);瑞戈非尼(批號:RGFN-B-190901、Z193-A1911001,由A公司提供);甲醇(默克試劑有限公司)、異丙醇、甲酸(阿拉丁有限公司)均為色譜級。

2 方法與結果

2.1 色譜條件液相色譜柱:Agilent RRHD C18(2.1 mm× 100 mm,1.8 μm);流速 0.3 mL·min-1;0.05%甲酸水為流動相A,甲醇為流動相B,梯度洗脫(0～1.2 min,10%B;1.2～4.0 min,10%B→60%B;4.0～8.0 min,60%B;8.0～13.0 min,95%B;13.0～13.10 min,95%B→10%B;13.10～15.0 min,10%B);柱溫35 ℃;進樣體積5 μL。

取0.6 ng·mL-1混標對照品溶液,在MRM模式下進樣分析,結果如圖2所示,各雜質之間分離度良好。

2.2 質譜條件采用電噴霧離子源(AJS ESI),正負離子檢測模式MRM采集(SM2正離子模式、SM3負離子模式),參數見表1。噴霧電壓為3.5 kV,鞘氣為250 ℃,鞘氣流速為11 L·min-1,霧化氣為45 psi,干燥氣溫度為300 ℃,干燥氣流速為5 L·min-1。

表1 MRM采集參數設置

母離子及子離子:取0.6 μg·mL-1混標對照品溶液,在Scan模式下進樣,進行MS分析,兩種基因毒性雜質的質譜圖如圖4 所示,其中3-氟-4-氨基苯酚的母離子為m/z 128.05,3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯的母離子為m/z 280.00。各基因毒性雜質的MRM參數見表1,定量離子及定性離子的選擇見表1。

圖4 定量限和檢測限MRM質譜圖

2.3 混標對照品溶液精密稱取3-氟-4-氨基苯酚對照品、3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯對照品各約6 mg,加稀釋劑異丙醇溶解并稀釋成 6 ng·mL-1的混標對照品儲備液。精密量取適量,稀釋10倍,作為0.6 ng·mL-1混標對照品溶液。

2.4 供試品溶液取本品約20 mg,精密稱定,置20 mL容量瓶,用稀釋劑溶解并稀釋到刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶。異丙醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(10 μg·mL-1)。

2.5 100%加標供試品溶液取本品約20 mg,精密稱定,置20 mL量瓶中,用異丙醇溶解稀釋至刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,加入1 mL對照品儲備液后,再用異丙醇稀釋至刻度,搖勻,作為100%加標供試品溶液。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性試驗取稀釋劑照上述條件進行試驗,記錄色譜圖,結果顯示稀釋劑不干擾測定,表明該方法專屬性良好。

2.6.2 線性關系、檢測限和定量限精密量取混標對照品儲備液適量,加稀釋劑稀釋得到濃度分別為 0.15、0.3、0.45、0.6、0.9、1.2 ng·mL-1的混標對照品溶液,進樣分析,繪制標準曲線,得線性方程(見表2)。逐步稀釋,考察定量限及檢測限(見圖4)。

表2 瑞戈非尼中兩種基因毒性雜質的線性范圍、定量檢測限及精密度

2.6.3 穩定性試驗取 “2.3”項下 0.6 ng·mL-1的混標對照品溶液,“2.5”項下10 μg·mL-1的100%加標供試品溶液,連續進樣16 h進行分析,各峰面積偏離度的絕對值在8 h內均小于17.22%,表明對照品溶液和100%加標供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.6.4 準確度和精密度試驗精密稱取瑞戈非尼(批號:RGFN-B-190901、Z193-A1911001)約20 mg,一式12份,分別置 20 mL 量瓶中,用異丙醇溶解稀釋至刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,精密加入“2.3”項下濃度為6 ng·mL-1的混標對照品儲備液溶液0.25、0.5、1.0、1.5 mL,分別溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得低(0.15 ng·mL-1,3份)、中(0.30 ng·mL-1,3份)、高(0.60 ng·mL-1,3份)、極高(0.90 ng·mL-1,3份)4 個濃度的供試品加標溶液,取混標對照品溶液和各加標供試品溶液分別進樣分析,外標法計算回收率結果見表3,各基因毒性雜質回收率均在90.64%～105.44%之間,RSD均小于3.50%,表明各基因毒性雜質回收率和精密度良好。

2.7 樣品測定取瑞戈非尼供試品2 批(批號:RGFN-B-190901、Z193-A1911001),每批精密稱取2份約 20 mg,置 20 mL 量瓶中,加稀釋劑溶解并稀釋至刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,異丙醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(10 μg·mL-1),進樣分析,結果2批次瑞戈非尼中SM2均未檢出,SM3均有檢出(見表4)。

表4 瑞戈非尼中基因毒性雜質檢測結果

3 討論

3.1 瑞戈非尼的合成工藝如圖1所示,以3-氟-4-氨基苯酚和N-甲基-4-氯-2-吡啶甲酰胺為原料、氫氧化鈉為堿,THF 為溶劑,回流反應得到中間體4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺,該中間體再與4-氯-3-三氟甲基苯胺以羰基連接得到瑞戈非尼無水物(4-[4-[[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰]氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺),加水而成。合成路線中涉及多個起始物料及中間體帶有基因警示結構,因此,必須對瑞戈非尼合成路線中引入的帶有基因警示結構的潛在基因毒性雜質進行控制。

3.2 控制限度參照瑞戈非尼片藥品使用說明書,建議每日最低劑量為80 mg,每日最高劑量為160 mg。因為瑞戈非尼為抗腫瘤用藥,可以不以ICH M7推薦的最嚴格的毒理學關注閾值(TTC,1.5 μg·d-1)為控制限制。本研究基于治療期,以相對嚴格的1～10年治療期的TTC(10 μg·d-1)為控制限制計算,瑞戈非尼中基因毒性雜質限度應為62.5×10-6,本研究以60×10-6作為瑞戈非尼中基因毒性雜質的控制限度。本次研究用樣品中未檢出SM2,檢出的SM3 分別為13.6×10-6、41.4×10-6,均符合限度要求,但SM3檢出量已超30%限度,值得關切。

3.3 色譜條件的優化色譜條件優化試驗中,探索了甲醇、異丙醇和乙腈 3 種有機相(B相),水相(A相)中添加不同比率的酸(0.1%甲酸水,0.05%甲酸水和0.1%乙酸水)對分離度和靈敏度的影響。結果顯示,采用 Agilent RRHD C18色譜柱,當流動相 0.05% 甲酸水溶液-甲醇梯度洗脫時,3-氟-4-氨基苯酚(SM2)、3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(SM3)響應較好,且兩個化合物分離度良好,故流動相中選擇0.05%甲酸水。本試驗考察了流速0.2～0.4 mL·min-1范圍內對苯胺類物質響應和峰形的影響,發現流速0.3 mL·min-1時,SM2,SM3離子化效率最高,出峰時間合適,且峰形較好。

3.4 質譜解析3-氟-4-氨基苯酚的質譜圖中m/z 128.05為[M+H]+離子,主要的碎片離子有m/z 108 和 m/z 81.1,其中 m/z 108為去氟基產物,反映了3-氟-4-氨基苯酚的結構特征。試驗對3-氟-4-氨基苯酚2個離子對 m/z 128.05→108 和 m/z 128.05→81.1的 MRM 參數見表1,其中,離子對m/z 128.05→108的信噪比較離子對 m/z 128.05→81.1更高,因此選擇m/z 128.05→108作為定量離子對,m/z 128.05→81.1作為定性離子對。本法中SM3檢測采用異丙醇衍生化,分析對象為SM3與異丙醇衍生后的產物。衍生產物精確分子量為281.04,其[M-H]-為280,反應過程見圖5。

圖5 SM3衍生化反應

SM3衍生產物,在質譜離子源中,子離子為酯鍵斷裂后重排的m/z,碎裂途徑見圖6。

圖6 SM3子離子裂解途徑

本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定瑞戈非尼中的2種基因毒性雜質(3-氟-4-氨基苯酚(SM2)、3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(SM3),并進行了方法學驗證,可以有效控制瑞戈非尼的潛在基因毒性雜質。該方法專屬性強,靈敏度高,滿足基因毒性雜質測定要求,可以作為瑞戈非尼原料藥中基因毒性雜質的質控方法。